Un plasmide est un morceau d’ADN circulaire que l’on trouve dans de nombreuses bactéries. La caractéristique la plus notable des plasmides est qu’ils se répliquent indépendamment de l’ADN principal de l’hôte. Souvent, un plasmide est utilisé dans la technologie du clonage recombinant pour cloner des gènes nouvellement isolés. Il est également très courant d’utiliser un plasmide recombinant pour exprimer de grandes quantités d’un gène connu afin d’en obtenir de l’ARN ou une protéine. Une telle expression de gènes recombinants a été indispensable pour l’industrie de la biotechnologie.
Les plasmides recombinants ont d’abord été développés chez le rat de laboratoire du monde bactérien, Escherichia coli. De nombreux autres types de bactéries peuvent héberger de tels plasmides. Ces morceaux d’ADN auto-répliquant peuvent se transférer naturellement entre différents types de bactéries. Malgré cela, il était parfois difficile d’introduire les plasmides recombinants dans d’autres types de bactéries.
La principale procédure d’introduction d’ADN dans d’autres cellules est connue sous le nom de transformation, dans laquelle les bactéries sont traitées avec des produits chimiques qui les rendent plus susceptibles d’absorber l’ADN étranger. Une autre technique consiste à choquer les bactéries avec un courant électrique. C’est ce qu’on appelle l’électroporation.
Les raisons de la création d’un plasmide recombinant varient. Souvent, lorsque l’ADN est isolé pour la première fois à partir d’un tissu ou d’un organisme particulier, il est transformé en plasmides pour créer une bibliothèque. Ensuite, l’ADN peut être extrait de colonies individuelles. Ensuite, ils peuvent être criblés par séquençage d’ADN pour déterminer quels types de gènes sont présents, si les séquences sont présentes dans une base de données. Parfois, des gènes aux fonctions inconnues sont clonés.
Dans d’autres cas, le produit du gène est bien connu, mais les chercheurs souhaitent en exprimer de grandes quantités pour une étude plus approfondie. Le gène peut être cloné dans des plasmides recombinants qui sont des vecteurs de surexpression. Ils sont spécialement conçus pour produire de grandes quantités d’ARN ou de protéines. Cela s’est avéré particulièrement utile pour les protéines humaines recombinantes, qui n’étaient auparavant souvent disponibles qu’à partir de cadavres, ce qui rend très difficile l’étude de la fonction d’un gène particulier.
Plusieurs facteurs sont impliqués dans la construction d’un plasmide qui peut être utilisé dans le clonage moléculaire. Le plasmide doit avoir un marqueur sélectionnable. Cela permet de sélectionner une cellule avec le gène. Normalement, la population de cellules dépourvues du gène avec le marqueur dépasse largement le nombre de cellules qui le portent. Généralement, un plasmide recombinant a une résistance à un antibiotique, ou peut croître en l’absence d’un acide aminé particulier.
Un tel plasmide a besoin d’une origine de réplication pour pouvoir commencer à synthétiser son ADN recombinant. De plus, un plasmide recombinant nécessite un ensemble de séquences spéciales pour permettre à une enzyme de restriction de cliver l’ADN pour permettre à un gène d’être inséré dans le vecteur de clonage. Il existe un grand nombre d’enzymes de restriction hautement spécialisées pour des séquences d’ADN spécifiques qui doivent être présentes là où le gène commence et se termine.
Des souches de bactéries traditionnelles sont utilisées pour le clonage d’ADN depuis des décennies. De plus, il existe de nouveaux kits qui utilisent des souches bactériennes spécialement construites pour faciliter la surexpression du produit génique. Ils combinent la technologie de clonage d’un gène avec une méthode qui permet une purification facile de la protéine exprimée à partir du gène une fois qu’il a été cloné dans le plasmide recombinant.