Le protocole de transfert de Western est les normes exactes selon lesquelles le test d’immunotransfert est effectué. Western blot est utilisé pour détecter des protéines dans un échantillon de tissu. Le procédé sépare les protéines natives en déterminant les longueurs des polypeptides à l’aide d’une électrophorèse sur gel. Les protéines elles-mêmes sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose et sondées par des anticorps.
La première partie du protocole western blot commence par la collecte de tissus. Ces échantillons sont prélevés soit à partir de tissus vivants, soit à partir d’une culture cellulaire. Le tissu est décomposé et divers inhibiteurs tels que la protéase ou la phosphatase sont introduits pour empêcher les enzymes d’effectuer la digestion. Cette partie du protocole est généralement manipulée à des températures froides pour préserver les tissus.
Le processus d’électrophorèse sur gel est la prochaine étape du protocole de transfert western. Dans cette portion, les protéines sont identifiées par divers facteurs tels que le poids moléculaire ou la charge électrique. Ce processus est le plus souvent complété en utilisant des gels de polyacrylamide avec un tampon de dodécyl sulfate de sodium. Fondamentalement, les protéines deviennent chargées négativement et se déplacent vers une électrode chargée positivement à l’intérieur du gel.
Le transfert des protéines est la partie suivante du processus global de transfert de Western. Une membrane est placée sur le gel, suivie d’un papier filtre. Lorsqu’un courant électrique est administré, les protéines sont attirées dans la membrane. C’est ce qu’on appelle la partie réelle de buvardage de l’analyse. Les membranes sont très fragiles et facilement susceptibles d’être endommagées.
Le déroulement correct du protocole western blot nécessite l’étape dite de liaison. Afin d’éviter la contamination des protéines elles-mêmes par les anticorps à ajouter, une sorte de blindage doit être mise en place. Le type de blocage le plus courant utilise du lait écrémé en poudre et un détergent. Cela se lie aux points ouverts de la membrane et permet d’obtenir des résultats plus clairs lorsque l’anticorps est ajouté.
La détection est la prochaine étape selon le protocole correct. Les protéines sont introduites dans des anticorps qui ont été liés à une enzyme spécifique qui donnera aux chercheurs les informations souhaitées. L’anticorps est incubé avec la membrane pendant 30 minutes ou plus. Ensuite, la membrane est lavée et un anticorps secondaire est introduit qui se lie au premier. Souvent, un agent luminescent est utilisé pour aider les scientifiques dans le processus d’identification.
Le matériau est à nouveau lavé pour éliminer les éléments non liés. L’analyse de la taille des bandes colorées révèle des informations concernant l’importance et l’étendue d’une protéine spécifique. Ceci est généralement effectué plusieurs fois pour assurer une analyse appropriée. Les options de détection comprennent les rayons X, la coloration et les produits chimiques.