L’assorbanza dello spettrofotometro si riferisce alla quantità di luce assorbita da una soluzione, misurata da uno strumento di laboratorio chiamato spettrofotometro di assorbanza. In chimica e biologia, gli spettrofotometri vengono utilizzati per una varietà di scopi. Possono aiutare a identificare i composti, determinare le concentrazioni di soluzioni o stimare il numero di cellule sospese in un liquido. Gli spettrofotometri funzionano dirigendo un insieme filtrato di determinate lunghezze d’onda della luce attraverso una soluzione campione e su un esposimetro. La quantità di luce trasmessa o assorbita dal campione, così come le lunghezze d’onda assorbite, rivelano alcune delle proprietà del campione.
La luce che gli esseri umani percepiscono visivamente è una forma di energia, radiazione elettromagnetica, e comprende una gamma di lunghezze d’onda su una piccola porzione dello spettro elettromagnetico. I raggi gamma, i raggi X e altre lunghezze d’onda corte inferiori a 400 nanometri (nm) non sono visibili all’occhio umano e nemmeno le lunghezze d’onda superiori a 700 nm, come la luce infrarossa o le onde radio. I colori che gli umani percepiscono vanno dalle onde blu e viola più corte intorno a 400 nm attraverso l’arcobaleno al rosso, che è più vicino a 700 nm. Gli spettrofotometri misurano nell’intervallo visibile con una certa sovrapposizione nelle sezioni ultraviolette e infrarosse dello spettro.
Quando vediamo un colore, ad esempio una foglia verde, stiamo vedendo le lunghezze d’onda della luce che vengono trasmesse da quell’elemento. Nel caso della foglia verde, un composto nelle cellule della pianta chiamato clorofilla assorbe le lunghezze d’onda blu e rosse dalla luce bianca del sole, ma non assorbe fortemente il verde. Invece, vengono trasmesse le lunghezze d’onda verde e quasi verde e la pianta appare verde.
In una data soluzione liquida, alcune lunghezze d’onda della luce saranno assorbite in quantità maggiori di altre. Gli spettrofotometri dirigono un raggio di luce bianca attraverso la soluzione campione in esame. L’assorbanza dello spettrofotometro è la quantità di luce che viene assorbita dal composto in esame. Questa luce viene assorbita in quantità variabili attraverso una gamma di lunghezze d’onda nota come spettro di assorbimento.
Lo spettro di assorbimento può aiutare a identificare il composto del campione. Ad esempio, alcuni pigmenti vegetali assorbono lunghezze d’onda diverse rispetto alla clorofilla e possono essere differenziati l’uno dall’altro in base ai loro grafici di assorbimento, grafici in cui l’assorbanza dello spettrofotometro viene visualizzata in funzione della lunghezza d’onda. Le lunghezze d’onda che vengono assorbite nella quantità maggiore appariranno come picchi sul grafico, dando al grafico di ogni composto una forma caratteristica.
La concentrazione di una soluzione può essere dedotta anche dalla sua assorbanza spettrofotometrica. Questo viene fatto attraverso la legge di Lambert-Beer, nota anche come legge di Beer, che è un’equazione che mette in relazione il livello di assorbanza dello spettrofotometro con la concentrazione attraverso altri due fattori: il coefficiente di estinzione e la lunghezza del percorso, o larghezza del tubo campione. Il coefficiente di estinzione è un fattore chimico diverso per ogni composto, ma può essere determinato testando un campione di concentrazione nota nello spettrofotometro. La legge di Beer può quindi essere utilizzata per risolvere le concentrazioni sconosciute dello stesso composto.