Bisulfit-Sequenzierung ist eine Methode, bei der verschiedene DNA-Regionen durch Methylierung analysiert werden. Methylierung ist der Prozess der Anlagerung eines bestimmten Moleküls, einer sogenannten Methylgruppe, an ein Nukleotid, in diesem Fall normalerweise ein Cytosin. Inaktive Nukleotide werden oft methyliert, sodass diese Methode für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden kann, von der Bestimmung aktiver Regionen eines Genoms bis hin zur Identifizierung genreicher Regionen. Bei der Bisulfit-Sequenzierung werden methylierte Cytosine durch den Sequenzierungsprozess nicht beeinflusst, während nicht-methylierte Cytosine in Uracil umgewandelt werden, ein Nukleotid, das normalerweise nicht im genetischen Material, der Desoxyribonukleinsäure (DNA), vorkommt.
Diese Methode reagiert sehr empfindlich auf Veränderungen der Methylierung, sodass kleine Veränderungen der Bindung Forschern spezifische Informationen über bestimmte Nukleotide geben können. Natriumbisulfit wandelt Cytosin in Uracil um, aber die Umwandlung findet in einer Umgebung statt, in der methyliertes Cytosin dieser Veränderung nicht unterliegt. Wenn die Bisulfit-Sequenzierung abgeschlossen ist, wurde die ursprüngliche DNA in ein deutlich anderes Molekül umgewandelt. Cytosine sind stark erschöpft oder fehlen möglicherweise. Findet sich in diesem umgewandelten Molekül noch ein Cytosin, handelt es sich im betrachteten Genom um ein natürlich methyliertes Cytosin.
Wie alle experimentellen Protokolle hat die Bisulfit-Sequenzierung Nachteile. Sein größter Nachteil ist, dass es eine sehr hohe Salzkonzentration erfordert, um richtig zu funktionieren. Das Salz fördert das Annealing von einzelsträngiger DNA in seine natürlichere Doppelhelix, und das Natriumbisulfit kann Cytosine nicht immer erreichen, wenn sie Teil der doppelsträngigen DNA sind. Wenn die Salzkonzentration zu hoch ist, werden einige Cytosine möglicherweise nicht in Uracil umgewandelt, was zu einer falschen Identifizierung von methylierten Cytosinen innerhalb eines Genoms führt. Denaturierende Mittel können erforderlich sein, um die Anzahl falsch positiver Identifizierungen zu minimieren.
Für die Bisulfit-Sequenzierung sind keine großen Mengen an Genomdaten erforderlich, daher bietet die Methode eine nützliche Anwendung bei der Analyse klinischer Proben. Die ursprüngliche Nukleinsäurequelle spielt keine Rolle, aber die Quelle muss DNA sein. Theoretisch könnte Ribonukleinsäure (RNA) mit dieser Methode sequenziert werden, da die meisten RNAs einzelsträngig sind und aufgrund blockierter Nukleotide nicht so anfällig für falsch positive Ergebnisse wären. In der Praxis ist die Bisulfit-Sequenzierung jedoch für RNA nicht sinnvoll, da RNA von Natur aus Uracil enthält. Ohne eine externe Markierung oder Ergänzung des Protokolls wären umgewandelte Cytosine nicht von natürlichem Uracil zu unterscheiden.
Bei jeder Art von Sequenzierungsmethodik sind Genauigkeit und Präzision von entscheidender Bedeutung. Sensible Methoden wie die Bisulfit-Sequenzierung bieten eine zuverlässige Methode zur Sequenzanalyse, die wiederum eine Genanalyse und die Identifizierung von Zielen für Medikamente und Therapien ermöglicht. Obwohl diese Methode nicht am lebenden Menschen angewendet werden kann, kann sie dennoch bei kleinsten Gewebeproben eine große Hilfe sein.