Ein Spektralfotometer ist eines der wissenschaftlichen Instrumente, die in vielen Forschungs- und Industrielabors üblich sind. Spektralphotometer werden für die Forschung in Physik, Molekularbiologie, Chemie und biochemischen Labors verwendet. Typischerweise bezieht sich der Name auf Ultraviolett-sichtbare (UV-Vis) Spektroskopie.
Die Energie des Lichts ist abhängig von seiner Wellenlänge, die üblicherweise als Lambda bezeichnet wird. Obwohl sich das elektromagnetische Spektrum über einen enormen Wellenlängenbereich erstreckt, können die meisten Labore nur einen kleinen Bruchteil davon messen. Die UV-Vis-Spektroskopie misst zwischen 200 und 400 Nanometer (nm) für UV-Lichtmessungen und bis zu etwa 750 nm im sichtbaren Spektrum.
Für die UV-Vis-Spektroskopie werden Proben normalerweise in kleinen Behältern, sogenannten Küvetten, aufbewahrt und gemessen. Diese können aus Kunststoff sein, wenn sie im sichtbaren Spektrum verwendet werden, müssen jedoch Quarz oder Quarzglas sein, wenn sie für UV-Messungen verwendet werden. Es gibt einige Maschinen, die Glasröhrchen verwenden können.
Die sichtbare Spektroskopie wird häufig industriell für die Kolorimetrie verwendet. Mit dieser Methode werden Proben bei mehreren Wellenlängen von 400-700 nm gemessen und ihre Absorptionsprofile werden mit einem Standard verglichen. Diese Technik wird häufig von Textil- und Tintenherstellern verwendet. Andere kommerzielle Anwender der UV-Vis-Spektroskopie sind forensische Labore und Drucker.
In der biologischen und chemischen Forschung werden Lösungen häufig durch Messung ihres Lichtabsorptionsgrades bei einer bestimmten Wellenlänge quantifiziert. Ein Wert, der Extinktionskoeffizient genannt wird, wird verwendet, um die Konzentration der Verbindung zu berechnen. Molekularbiologische Labore verwenden beispielsweise Spektralfotometer, um die Konzentrationen von DNA- oder RNA-Proben zu messen. Sie verfügen manchmal über ein fortschrittliches Gerät namens NanoDrop™-Spektralfotometer, das im Vergleich zu herkömmlichen Spektralfotometern einen Bruchteil der Probenmenge verwendet.
Damit die Quantifizierung gültig ist, muss die Probe dem Lambert-Beer-Gesetz entsprechen. Dies erfordert, dass die Extinktion direkt proportional zur Weglänge der Küvette und der Absorption der Verbindung ist. Für viele, aber nicht alle Verbindungen gibt es Extinktionskoeffiziententabellen.
Viele chemische und enzymatische Reaktionen ändern im Laufe der Zeit ihre Farbe, und Spektralphotometer sind sehr nützlich, um diese Veränderungen zu messen. Zum Beispiel oxidieren die Polyphenoloxidase-Enzyme, die Früchte braun werden lassen, Lösungen phenolischer Verbindungen, wodurch klare Lösungen in sichtbar gefärbte umgewandelt werden. Solche Reaktionen können untersucht werden, indem die Zunahme der Extinktion bei Farbänderung gemessen wird. Idealerweise ist die Änderungsrate linear, und man kann aus diesen Daten Raten berechnen. Ein fortschrittlicheres Spektrophotometer verfügt über einen temperaturgesteuerten Küvettenhalter, um die Reaktionen bei einer genauen Temperatur durchzuführen, die für das Enzym ideal ist.
Mikrobiologische und molekularbiologische Laboratorien verwenden häufig ein Spektrophotometer, um das Wachstum von Bakterienkulturen zu messen. DNA-Klonierungsexperimente werden häufig in Bakterien durchgeführt, und Forscher müssen das Wachstumsstadium der Kultur messen, um zu wissen, wann bestimmte Verfahren durchzuführen sind. Sie messen die Absorption, die als optische Dichte (OD) bekannt ist, auf einem Spektrophotometer. An der OD kann man erkennen, ob sich die Bakterien aktiv teilen oder zu sterben beginnen.
Spektralphotometer verwenden eine Lichtquelle, um ein Array von Wellenlängen durch einen Monochromator zu strahlen. Dieses Gerät lässt dann ein schmales Lichtband durch, und das Spektrophotometer vergleicht die Lichtintensität, die durch die Probe geht, mit derjenigen, die durch eine Referenzverbindung geht. Wenn beispielsweise eine Verbindung in Ethanol gelöst wird, wäre die Referenz Ethanol. Das Ergebnis wird als Extinktionsgrad der Differenz zwischen ihnen angezeigt. Dies zeigt die Extinktion der Probenverbindung an.
Der Grund für diese Absorption ist, dass sowohl ultraviolettes als auch sichtbares Licht genügend Energie haben, um die Chemikalien zu höheren Energieniveaus anzuregen. Diese Anregung führt zu einer höheren Wellenlänge, die sichtbar wird, wenn die Extinktion gegen die Wellenlänge aufgetragen wird. Verschiedene Moleküle oder anorganische Verbindungen absorbieren Energie bei verschiedenen Wellenlängen. Diejenigen mit maximaler Absorption im sichtbaren Bereich werden vom menschlichen Auge als gefärbt angesehen.
Lösungen von Verbindungen können klar sein, aber im UV-Bereich absorbieren. Solche Verbindungen haben normalerweise Doppelbindungen oder aromatische Ringe. Manchmal gibt es einen oder mehrere nachweisbare Peaks, wenn der Absorptionsgrad gegen die Wellenlänge aufgetragen wird. Wenn dies der Fall ist, kann dies bei der Identifizierung einiger Verbindungen helfen, indem die Form des Diagramms mit der von bekannten Referenzdiagrammen verglichen wird.
Es gibt zwei Arten von UV-Vis-Spektrophotometer-Geräten, Einstrahl- und Zweistrahl-Maschinen. Diese unterscheiden sich darin, wie sie die Lichtintensität zwischen Referenz- und Prüfling messen. Zweistrahlmaschinen messen die Referenz- und Testverbindung gleichzeitig, während Einstrahlmaschinen vor und nach der Zugabe der Testverbindung messen.