O sequenciamento de bissulfito é um método no qual diferentes regiões do DNA são analisadas por metilação. Metilação é o processo de adição de uma molécula específica, chamada grupo metil, a um nucleotídeo, neste caso geralmente uma citosina. Os nucleotídeos inativos são frequentemente metilados, então esse método pode ser usado para uma variedade de propósitos, desde a determinação de regiões ativas de um genoma até a identificação de regiões ricas em genes. No sequenciamento de bissulfito, as citosinas metiladas não são afetadas pelo processo de sequenciamento, enquanto as citosinas não metiladas são convertidas em uracila, um nucleotídeo geralmente não encontrado no material genético, o ácido desoxirribonucléico (DNA).
Este método é muito sensível a mudanças na metilação, então pequenas mudanças na ligação podem dar aos pesquisadores informações específicas sobre nucleotídeos específicos. O bissulfito de sódio converte a citosina em uracila, mas a conversão ocorre em um ambiente onde a citosina metilada não sofrerá essa alteração. Quando o sequenciamento do bissulfito está completo, o DNA original foi convertido em uma molécula significativamente diferente. As citosinas estarão muito esgotadas ou potencialmente ausentes. Se uma citosina ainda for encontrada nesta molécula convertida, ela representa uma citosina naturalmente metilada no genoma em consideração.
Como todos os protocolos experimentais, o sequenciamento de bissulfito tem desvantagens. Sua desvantagem mais significativa é que ele requer uma concentração de sal muito alta para funcionar corretamente. O sal estimula o recozimento do DNA de fita simples em sua dupla hélice mais natural, e o bissulfito de sódio nem sempre consegue alcançar as citosinas quando fazem parte do DNA de fita dupla. Se a concentração de sal for muito alta, várias citosinas podem não ser convertidas em uracila, resultando na falsa identificação de citosinas metiladas dentro de um genoma. Os agentes desnaturantes podem ser necessários para minimizar o número de identificações positivas falsas.
Grandes quantidades de dados genômicos não são necessários para o sequenciamento de bissulfito, portanto, o método tem uma aplicação útil na análise de amostras clínicas. A fonte original do ácido nucléico não importa, mas a fonte deve ser o DNA. Em teoria, o ácido ribonucleico (RNA) poderia ser sequenciado usando esse método, uma vez que a maioria do RNA é de fita simples e não seria tão suscetível a falsos positivos por causa de nucleotídeos bloqueados. Quando colocado em prática, no entanto, o sequenciamento do bissulfito não é útil para o RNA, porque o RNA naturalmente contém uracila. Sem algum tipo de marcação externa ou adição ao protocolo, as citosinas convertidas seriam indistinguíveis do uracil natural.
Ao realizar qualquer tipo de metodologia de sequenciamento, exatidão e precisão são essenciais. Métodos sensíveis como o sequenciamento de bissulfito oferecem um meio confiável de análise de sequência, que por sua vez permite a análise de genes e a identificação de alvos para drogas e terapias. Embora esse método não possa ser usado em pessoas vivas, ele ainda pode ser de grande ajuda apenas com as menores amostras de tecido para trabalhar.