Esistono centinaia di metodi diversi per la determinazione della concentrazione proteica. L’incredibile diversità nei tipi di soluzioni proteiche analizzate dai biochimici è il motivo per cui non esiste un unico metodo universale che funzioni per ogni tipo di soluzione proteica. I saggi proteici più comuni sono il saggio di Bradford, il saggio di Lowry e il saggio dell’acido bicinconinico. Tuttavia, sono state sviluppate una miriade di variazioni necessarie per aggirare qualsiasi potenziale incompatibilità chimica tra la soluzione proteica e i reagenti utilizzati nel dosaggio.
In generale, ci sono due categorie principali di saggi per la determinazione della concentrazione proteica. Nel primo gruppo di metodi, un colorante colorato o fluorescente viene aggiunto a una soluzione proteica e si lega specificamente alle proteine. Il colorante legato ha una lunghezza d’onda di assorbimento unica che è proporzionale alla quantità di proteine. Utilizzando uno spettrometro, diventa possibile stimare la concentrazione di proteine.
Il secondo gruppo di analisi prevede l’aggiunta di ioni rame(II) a una soluzione di proteine, dove questi ioni vengono ridotti a ioni rame(I). Questi ioni ridotti sono quindi in grado di formare complessi colorati legandosi alle proteine. Misurando le assorbanze alle loro lunghezze d’onda uniche, si possono anche dedurre le concentrazioni di proteine.
Uno dei metodi più popolari per la determinazione della concentrazione proteica è il saggio Bradford. In questo saggio, un colorante rosso chiamato blu brillante di coomassie viene aggiunto a una soluzione proteica in condizioni acide. Poiché questo colorante si lega alle proteine, forma un complesso blu permanente con un’assorbanza caratteristica a 595 nanometri.
Nonostante la versatilità generale del saggio Bradford, è incompatibile con alcune soluzioni proteiche. In particolare, il saggio Bradford è interrotto dalla presenza di sodio dodecil solfato (SDS), un detergente comunemente usato per purificare le proteine e scomporre le cellule mediante lisi. Questo detergente interferisce con il legame del colorante alle proteine, il che si traduce in una lettura dell’assorbimento inaffidabile e imprecisa. Altri tipi di metodi, poi, devono essere usati quando è presente la SDS.
È stata sviluppata un’altra serie di test proteici e tutti comportano una variazione del test Biuret. In questa reazione, una proteina viene combinata con una base acquosa e ioni rame(II). Questi ioni vengono ridotti e quindi chelati dalle proteine per formare complessi colorati. Due saggi che utilizzano questo test sono il saggio di Lowry e il saggio dell’acido bicinconinico.
Con il saggio di Lowry, al test Biuret viene aggiunto un reagente di Folin-Ciocalteu. Il reagente di Folin-Ciocalteu ossida i residui aromatici, in particolare il triptofano, e aiuta il complesso ad assorbire fortemente a 750 nanometri. Il dosaggio dell’acido bicinconinico, invece, prevede l’aggiunta di acido bicinconinico al test Biuret. Dopo una breve incubazione a circa 104° Fahrenheit (40° Celsius), due equivalenti di acido e i legami peptidici della proteina chelano un singolo ione rame(I). Il risultato è un complesso che assorbe fortemente a 562 nanometri.
Quando si seleziona un metodo per la determinazione della concentrazione proteica, è importante considerare i diversi gruppi funzionali chimici presenti nella soluzione. La presenza di alcune catene laterali di amminoacidi, legami disolfuro e cofattori può rendere la determinazione della concentrazione proteica estremamente imprecisa. Spesso è necessario considerare non solo le proteine ma anche altri reagenti e tamponi, come agenti riducenti e detergenti. Il metodo ideale sarà chimicamente compatibile, affidabile, economico e semplice da configurare.