Il protocollo Western blot è lo standard esatto in base al quale viene condotto il test immunoblot. Western blot viene utilizzato per rilevare le proteine in un campione di tessuto. Il processo separa le proteine native determinando le lunghezze dei polipeptidi utilizzando un’elettroforesi su gel. Le proteine stesse vengono quindi trasferite su una membrana di nitrocellulosa e sondate dagli anticorpi.
La prima parte del protocollo western blot inizia con la raccolta dei tessuti. Questi campioni vengono raccolti da tessuto vivente o da una coltura cellulare. Il tessuto viene scomposto e vengono introdotti vari inibitori come la proteasi o la fosfatasi per impedire agli enzimi di eseguire la digestione. Questa parte del protocollo viene solitamente gestita a basse temperature per preservare i tessuti.
Il processo di elettroforesi su gel è il passo successivo nel protocollo western blot. In questa porzione le proteine sono identificate da vari fattori come il peso molecolare o la carica elettrica. Questo processo è più comunemente completato utilizzando gel di poliacrilammide con un tampone di sodio dodecil solfato. Fondamentalmente, le proteine si caricano negativamente e si spostano verso un elettrodo caricato positivamente all’interno del gel.
Il trasferimento delle proteine è la parte successiva dell’intero processo di western blot. Una membrana viene posta sopra il gel, seguita da carta da filtro. Quando viene somministrata una corrente elettrica, le proteine vengono trascinate nella membrana. Questo è indicato come l’effettiva porzione di “blotting” dell’analisi. Le membrane sono altamente fragili e facilmente suscettibili di danneggiamento.
Il corretto flusso del protocollo Western blot richiede il passaggio noto come associazione. Al fine di prevenire la contaminazione delle proteine stesse da parte degli anticorpi da aggiungere, occorre attuare una sorta di schermatura. Il tipo più comune di blocco utilizza latte in polvere scremato e un detersivo. Questo si lega ai punti aperti nella membrana e consente risultati più chiari quando viene aggiunto l’anticorpo.
Il rilevamento è il passaggio successivo in base al protocollo corretto. Le proteine vengono introdotte in anticorpi che sono stati collegati a un enzima specifico che fornirà ai ricercatori le informazioni desiderate. L’anticorpo viene incubato con la membrana per 30 minuti o più. Successivamente, la membrana viene lavata e viene introdotto un anticorpo secondario che si lega al primo. Spesso, un agente luminescente viene utilizzato per assistere gli scienziati nel processo di identificazione.
Il materiale viene nuovamente lavato per rimuovere eventuali elementi non legati. L’analisi della dimensione delle bande colorate rivela informazioni riguardanti la prominenza e l’estensione di una specifica proteina. Questo è generalmente completato alcune volte per garantire un’analisi corretta. Le opzioni per il rilevamento includono raggi X, coloranti e sostanze chimiche.