La citometria a flusso è lo studio delle singole cellule mentre passano attraverso un flusso liquido. I componenti della cellula, internamente o sulla superficie, devono prima essere etichettati con uno o più coloranti fluorescenti. Un laser all’interno di uno strumento chiamato citometro a flusso eccita queste molecole fluorescenti in modo che emettano luce a varie lunghezze d’onda. La quantità di fluorescenza può dare un’indicazione sulla percentuale di vari tipi di cellule presenti nel campione. La citometria a flusso viene utilizzata nei laboratori per una varietà di applicazioni tra cui ricerca sul cancro, immunologia e analisi del ciclo cellulare.
Per eseguire l’analisi della citometria a flusso, una sospensione di singole cellule deve essere colorata con coloranti fluorescenti, operazione che può essere eseguita con un processo a una o due fasi. Le proteine cellulari sono spesso colorate usando anticorpi diretti contro la proteina di interesse. Un processo in un’unica fase prevede la colorazione delle cellule con anticorpi già marcati con colorante fluorescente. Se gli anticorpi marcati non sono disponibili, le cellule possono essere colorate prima con un anticorpo primario non marcato e poi con un anticorpo secondario marcato fluorescente.
Una volta che le cellule sono etichettate, sono pronte per l’analisi di citometria a flusso. Sul citometro a flusso viene caricata una provetta contenente la sospensione di cellule. Le cellule fluiscono attraverso lo strumento e passano davanti a un laser in fila indiana. Quando il laser colpisce ogni cellula, la luce viene diffusa in avanti o lateralmente. Le misurazioni della dispersione in avanti danno un’indicazione della dimensione delle cellule, mentre la dispersione laterale è una misura della granularità delle cellule.
L’energia del laser eccita anche le molecole di fluorocromo, il colorante fluorescente utilizzato per colorare le cellule. Un laser comune utilizzato per la citometria a flusso è il laser a ioni di argon che emette luce a una lunghezza d’onda di 488 nanometri (nm). Questa luce eccita le molecole della fluoresceina colorante verde, che quindi emette luce a una lunghezza d’onda di 525 nm. I tubi fotomoltiplicatori (PMT) nel citometro a flusso hanno filtri di luce che rilevano la luce emessa dai vari fluorocromi. Lo strumento può avere diversi PMT che rilevano la luce a diverse lunghezze d’onda.
Il diodo rosso, il diodo viola o He-Ne (elio-neon) sono altri laser che possono essere utilizzati in un citometro a flusso. Altri fluorocromi utilizzati nell’analisi della citometria a flusso includono la ficoeritrina, il rosso del Texas o l’alloficocianina. Diverse combinazioni di laser e fluorocromi consentono al ricercatore di raccogliere informazioni su molti diversi marcatori cellulari nello stesso esperimento.
Il software progettato per l’uso con il citometro a flusso aiuta il ricercatore nella visualizzazione dei dati. Le popolazioni cellulari vengono analizzate utilizzando dot plot, densità o istogrammi. Le regioni possono essere disegnate attorno alle cellule di interesse e l’intensità della fluorescenza può dare un’indicazione delle percentuali di varie cellule nel campione.