Un microscopio confocal es un tipo particular de microscopio fluorescente que se utiliza para obtener imágenes 2D y 3D de alta calidad. Con un microscopio fluorescente básico (de campo amplio), se ilumina una muestra con luz de una longitud de onda particular, y la muestra absorbe parte de esa luz y refleja el resto a una longitud de onda más larga. La luz de longitud de onda más larga pasa a través de un espejo dicroico, lo que permite que pase la luz de longitud de onda más larga, pero no la luz de longitud de onda original (más corta). La persona que mira la muestra solo ve la luz que ha atravesado el espejo dicroico. Los microscopios fluorescentes básicos capturan tanto la luz enfocada como desenfocada, lo que funciona bien para muestras grandes donde no se requiere una resolución muy alta. No funciona tan bien para ver detalles finos. Se necesita un microscopio confocal para capturar imágenes fluorescentes de alta resolución.
El microscopio confocal utiliza un orificio para rechazar la luz desenfocada. En lugar de que la luz pase solo a través de un espejo dicroico, la luz pasa a través de un espejo dicroico y un orificio, lo que significa que la persona que mira la muestra ve solo un punto de la muestra. Para ver una muestra completa, los espejos móviles escanean la luz a través de un plano rectangular de la muestra, y una computadora recolecta la luz emitida a medida que se escanea la muestra. Un escaneo completo dará como resultado un corte óptico, o sección transversal, de la muestra. Este tipo de microscopía se denomina microscopía de barrido láser confocal, en parte porque se utiliza un láser como fuente de luz.
Para crear una imagen 3D, se realizan varios escaneos, creando varios «cortes» de la muestra, y una computadora combina cada corte para crear una imagen tridimensional. El microscopio se puede programar para variar el espacio entre cortes, dependiendo de qué tan nítida sea la imagen 3D que el usuario quiera obtener. El microscopio también puede variar la velocidad a la que escanea una imagen, y el escaneo lento proporciona una resolución más alta que el escaneo rápido.
El microscopio confocal se ha convertido en un equipo de uso muy común en muchos laboratorios de ciencias de la vida. Son caras, algo grandes y, a menudo, tienen salas dedicadas a su uso, porque la sala debe estar oscura para obtener una buena imagen fluorescente. Aunque los microscopios confocales se usan con mayor frecuencia para ver células y estructuras dentro de las células, se pueden usar para obtener una imagen de cualquier muestra fluorescente tridimensional y, a veces, se usan para ver materiales semiconductores.