La quantificazione dell’acido ribonucleico (RNA) è un mezzo per determinare la concentrazione media di RNA in una soluzione. Questa determinazione può essere eseguita utilizzando una varietà di procedure, che di solito rientrano in una delle due categorie: spettrofotometria o quantificazione di coloranti fluorescenti. La spettrofotometria si basa sulla capacità dell’RNA di assorbire determinate lunghezze d’onda della luce ultravioletta. Alcuni coloranti fluorescenti, come il bromuro di etidio, possono legarsi ad acidi nucleici come l’RNA e diventano fluorescenti quando si legano, consentendo di misurare la luminosità.
Quando l’RNA è esposto alla luce ultravioletta, assorbirà selettivamente questa luce alle lunghezze d’onda di 260 nanometri (nm) e 280 nm. Questo metodo viene eseguito in uno spettrofotometro, che produce lunghezze d’onda della luce ultravioletta e misura la luce che passa attraverso l’RNA. Maggiori concentrazioni di RNA assorbiranno più luce.
Una combinazione di queste due lunghezze d’onda viene spesso utilizzata nella quantificazione dell’RNA poiché questo metodo consente ai ricercatori di sapere se un campione è contaminato da altre macromolecole, come le proteine. Questi contaminanti spesso assorbono selettivamente la luce a 280 nm, ma non la luce a 260 nm. Di conseguenza, il calcolo del rapporto tra la luce assorbita a entrambe le lunghezze d’onda può determinare il grado di contaminazione.
La quantificazione dell’RNA mediante coloranti fluorescenti fornisce risultati meno suscettibili ad alcuni contaminanti e può essere utilizzata con bassi livelli di RNA che renderebbero impossibile la spettrofotometria. Coloranti come il bromuro di etidio si legano all’RNA e la luminosità risultante può essere misurata direttamente utilizzando fotometri a fluorescenza. Se non è disponibile un fotometro, si possono preparare soluzioni con concentrazioni note di RNA e la luminosità del campione sconosciuto può essere approssimativamente paragonata a queste. La relazione tra luminosità e concentrazione di RNA è lineare, quindi i ricercatori possono determinare rapidamente una misurazione della concentrazione dalla luminosità.
La quantificazione dell’RNA utilizzando entrambi i metodi può essere altamente suscettibile a diversi contaminanti. Proteine, fenolo e particelle di grandi dimensioni possono rendere imprecisi i risultati della spettrofotometria. Questi contaminanti non influiscono sulla quantificazione dell’RNA del colorante fluorescente, ma questo metodo può essere reso impreciso dalla presenza di acido desossiribonucleico (DNA) in un campione.
I coloranti che legano gli acidi nucleici legheranno sia il DNA che l’RNA e mostreranno luminosità simili, quindi è importante garantire un campione pulito di RNA. Il modo normale per ottenere ciò è aggiungere un enzima che distrugge il DNA, come la DNAsi, a un campione misto prima di aggiungere un colorante. A seconda della concentrazione di RNA in un campione e dei contaminanti presenti, i laboratori possono utilizzare uno di questi metodi per quantificare l’RNA.