Agarosegel ist eine Substanz, die in der Biochemie und Biotechnologie für die Gelelektrophorese und Größenausschlusschromatographie verwendet wird, bei denen es sich um Verfahren zur Sortierung großer Moleküle nach ihrer Größe und elektrischen Ladung handelt. Diese Prozesse verwenden Agarose, um Proteine und DNA zu trennen und zu analysieren. Es ist für diese Anwendungen aufgrund seiner molekularen Struktur sehr geeignet, die es Molekülen unterschiedlicher Größe ermöglicht, sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch es hindurch zu bewegen. Das Material wird aus verschiedenen Algenarten gewonnen und findet sich in der Regel in Pulverform in Laboratorien. Um ein geeignetes Medium für einen gegebenen Test herzustellen, wird das Pulver in der geeigneten Konzentration zu Wasser gegeben, gekocht und dann zu einem Gel abkühlen gelassen.
Herstellung
Agarose wird in Form von Agar aus mehreren Arten von roten Meeresalgen oder Algen gewonnen, die in Kalifornien und Ostasien vorkommen. Agar, ein Begriff, abgeleitet vom malaiischen Wort Agar-Agar, was Gelee bedeutet, wird typischerweise aus den Gelidium-Algenarten gewonnen. Es besteht aus zwei verschiedenen Substanzen, Agarose und Agaropektin, und unterstützt die Zellwände der Meeresalgen. Nach dem Entfernen kann der Agar als Lebensmittelverdickungsmittel, ähnlich wie Gelatine, oder als Abführmittel verwendet werden. Wenn es gereinigt ist, kann es als Medium für das Züchten von Bakterien, Pilzen oder anderen Mikroorganismen verwendet werden.
Es ist ziemlich einfach, Agarose von Agaropektin in Agar zu trennen, weil die Agarosemoleküle stark aneinander binden, während das Agaropektin schlecht geliert. Es gibt mehrere Methoden, um die Isolierung von Agarose zu erreichen. Bei einer Methode werden dem Agar Carrageenan, ein weiteres Molekül, das in Rotalgen gefunden wird, und ein Salz zugesetzt. Dadurch fällt das Agaropektin aus oder bildet einen Feststoff, der aus der Agarlösung entfernt werden kann. Eine andere Methode fügt das Enzym Pektinase hinzu, eine Chemikalie, die das Agaropektin abbaut, sodass es sich in Wasser auflösen kann.
Gel-Elektrophorese
Agarosegel wird am häufigsten mit Elektrophorese in Verbindung gebracht. Bei diesem Verfahren legen Wissenschaftler ein elektrisches Feld über eine Platte des Materials an, das gelöste DNA-, RNA- oder Proteinfragmente enthält. Dies führt dazu, dass sich diese großen Moleküle aufgrund ihrer elektrischen Ladungen bewegen: positiv geladene Typen bewegen sich zur negativen Seite und umgekehrt. DNA- und RNA-Fragmente haben eine negative Ladung und bewegen sich daher zum positiven Ende, während Proteinfragmente entweder negativ oder positiv sein können.
Die Geschwindigkeit, mit der sich die Moleküle bewegen, hängt von ihrer Größe und ihrer Ladung ab. Agarosegel ist so aufgebaut, dass es eine Art Netz bildet, mit Löchern, durch die andere Moleküle wandern können. Kleinere können leichter durch die Löcher gehen und reisen daher schneller. Bei den größeren Molekülen spielt auch die Form eine Rolle, da die kompakteren mit leichter durchgehen. Die Technik wird sowohl zur Analyse von Proben als auch zur Isolierung bestimmter DNA-Sequenzen für den Einsatz in biotechnologischen Anwendungen verwendet.
Vor der Elektrophorese wird eine DNA-Probe mit speziellen Enzymen behandelt, die die langen, strangförmigen Moleküle an bestimmten Stellen zerschneiden und so kleinere Fragmente erzeugen. Das Agarosegel wird durch Auflösen des Pulvers in einer Pufferlösung hergestellt, die pH-Änderungen – Säure/Alkalinität – widersteht, die ansonsten aus elektrochemischen Effekten resultieren könnten. Für unterschiedliche Molekülbereiche werden unterschiedliche Pulvermengen verwendet, aber normalerweise liegt die Konzentration zwischen 0.7 und 1.2%. An dieser Stelle wird normalerweise ein fluoreszierender Farbstoff namens Ethidiumbromid hinzugefügt, da er DNA färbt und unter ultraviolettem Licht gut sichtbar macht. Diese Mischung wird dann in der Mikrowelle erhitzt und erstarren gelassen.
Die DNA-Proben werden in kleine Vertiefungen im Gel gegeben und ein elektrischer Gleichstrom darüber angelegt. Moleküle unterschiedlicher Größe wandern mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten über das Gel, sodass sie nach einer bestimmten Zeit an verschiedenen Positionen erscheinen, wobei die kleineren Fragmente weiter zum positiven Ende hin liegen. Dadurch können die Wissenschaftler die Größe der Fragmente bestimmen und verschiedene DNA-Sequenzen isolieren.
andere Verwendungen
Agarosegel wird manchmal in einer verwandten Technik verwendet, bei der kein Strom verwendet wird, die als Größenausschlusschromatographie bekannt ist. Bei dieser Methode wird eine Glassäule mit Kügelchen aus Gel gefüllt und eine Lösung mit unterschiedlich großen Molekülen eingefüllt von kleineren wird in den Perlen verlangsamt. Dies liegt daran, dass die kleinen Moleküle dazu neigen, in die Poren des Gels absorbiert zu werden, während die größeren zu groß sind, um in diese Poren einzudringen und stattdessen dazu neigen, zwischen den Kügelchen zu fließen. Geltyp und Konzentration können an die zu trennenden Molekülgrößen angepasst werden.