El protocolo de inmunotransferencia es el estándar exacto por el que se realiza la prueba de inmunotransferencia. El Western blot se utiliza para detectar proteínas en una muestra de tejido. El proceso separa las proteínas nativas determinando las longitudes de los polipéptidos usando una electroforesis en gel. Las proteínas mismas se transfieren luego a una membrana de nitrocelulosa y se sondean mediante anticuerpos.
La primera parte del protocolo de Western Blot comienza con la recolección de tejido. Estas muestras se obtienen de tejido vivo o de un cultivo celular. El tejido se descompone y se introducen varios inhibidores como la proteasa o la fosfatasa para evitar que las enzimas realicen la digestión. Esta parte del protocolo generalmente se maneja en temperaturas frías para preservar los tejidos.
El proceso de electroforesis en gel es el siguiente paso en el protocolo de transferencia Western. En esta porción, las proteínas se identifican por varios factores como el peso molecular o la carga eléctrica. Este proceso se completa más comúnmente usando geles de poliacrilamida con un tampón de dodecilsulfato de sodio. Básicamente, las proteínas se cargan negativamente y se mueven hacia un electrodo cargado positivamente dentro del gel.
La transferencia de las proteínas es la siguiente parte del proceso general de transferencia de Western. Se coloca una membrana sobre el gel, seguida de papel de filtro. A medida que se administra una corriente eléctrica, las proteínas se introducen en la membrana. Esto se conoce como la parte de «borrado» real del análisis. Las membranas son muy frágiles y fácilmente susceptibles de dañarse.
El flujo correcto del protocolo de transferencia occidental requiere el paso conocido como enlace. Para evitar la contaminación de las propias proteínas por los anticuerpos que deben agregarse, es necesario implementar una especie de blindaje. El tipo de bloqueo más común utiliza leche en polvo sin grasa y un detergente. Esto se une a los puntos abiertos de la membrana y permite obtener resultados más claros cuando se agrega el anticuerpo.
La detección es el siguiente paso según el protocolo correcto. Las proteínas se introducen en anticuerpos que se han vinculado a una enzima específica que proporcionará a los investigadores la información deseada. El anticuerpo se incuba con la membrana durante 30 minutos o más. Posteriormente, se lava la membrana y se introduce un anticuerpo secundario que se une al primero. A menudo, se utiliza un agente luminiscente para ayudar a los científicos con el proceso de identificación.
El material se vuelve a lavar para eliminar los elementos no unidos. El análisis del tamaño de las bandas teñidas revela información sobre la prominencia y extensión de una proteína específica. Por lo general, esto se completa varias veces para garantizar un análisis adecuado. Las opciones de detección incluyen rayos X, colorantes y productos químicos.