La cytométrie en flux est l’étude de cellules individuelles lorsqu’elles traversent un flux liquide. Les composants de la cellule, que ce soit à l’intérieur ou à la surface, doivent d’abord être marqués avec un ou plusieurs colorants fluorescents. Un laser à l’intérieur d’un instrument appelé cytomètre en flux excite ces molécules fluorescentes afin qu’elles émettent de la lumière à différentes longueurs d’onde. La quantité de fluorescence peut donner une indication sur le pourcentage de divers types de cellules présents dans l’échantillon. La cytométrie en flux est utilisée dans les laboratoires pour diverses applications, notamment la recherche sur le cancer, l’immunologie et l’analyse du cycle cellulaire.
Pour effectuer une analyse par cytométrie en flux, une suspension de cellules individuelles doit être colorée avec des colorants fluorescents, ce qui peut être fait en une étape ou en deux étapes. Les protéines cellulaires sont souvent colorées à l’aide d’anticorps dirigés contre la protéine d’intérêt. Un processus en une étape consiste à colorer les cellules avec des anticorps déjà marqués avec un colorant fluorescent. Si des anticorps marqués ne sont pas disponibles, les cellules peuvent être colorées d’abord avec un anticorps primaire non marqué, puis avec un anticorps secondaire marqué par fluorescence.
Une fois les cellules marquées, elles sont prêtes pour l’analyse par cytométrie en flux. Un tube contenant la suspension de cellules est chargé sur le cytomètre en flux. Les cellules traversent l’instrument et passent devant un laser en file indienne. Lorsque le laser frappe chaque cellule, la lumière est diffusée vers l’avant ou latéralement. Les mesures de diffusion vers l’avant donnent une indication de la taille des cellules, tandis que la diffusion latérale est une mesure de la granularité des cellules.
L’énergie du laser excite également les molécules de fluorochrome, le colorant fluorescent utilisé pour colorer les cellules. Un laser couramment utilisé pour la cytométrie en flux est le laser argon-ion qui émet de la lumière à une longueur d’onde de 488 nanomètres (nm). Cette lumière excite les molécules du colorant vert fluorescéine, qui émet alors de la lumière à une longueur d’onde de 525 nm. Les tubes photomultiplicateurs (PMT) du cytomètre en flux sont dotés de filtres lumineux qui détectent la lumière émise par les différents fluorochromes. L’instrument peut avoir plusieurs PMT qui détectent la lumière à différentes longueurs d’onde.
La diode rouge, la diode violette ou He-Ne (hélium-néon) sont d’autres lasers qui peuvent être utilisés dans un cytomètre en flux. D’autres fluorochromes utilisés dans l’analyse par cytométrie en flux comprennent la phycoérythrine, le rouge Texas ou l’allophycocyanine. Différentes combinaisons de lasers et de fluorochromes permettent au chercheur de collecter des informations sur de nombreux marqueurs cellulaires différents dans la même expérience.
Un logiciel conçu pour être utilisé avec le cytomètre en flux aide le chercheur à visualiser les données. Les populations cellulaires sont analysées à l’aide de tracés de points, de tracés de densité ou d’histogrammes. Des régions peuvent être dessinées autour des cellules d’intérêt et l’intensité de fluorescence peut donner une indication des pourcentages de diverses cellules dans l’échantillon.