Il metodo shotgun viene utilizzato per sequenziare lunghi filamenti di una molecola di acido desossiribonucleico (DNA). Si basa su un altro metodo di sequenziamento del DNA chiamato metodo di terminazione della catena. Con il metodo shotgun, gli scienziati mettono in sequenza parti del filamento di DNA e utilizzano i risultati per creare una sequenza continua.
Il sequenziamento è il processo per trovare la composizione atomica di una molecola e studiare i legami chimici che uniscono quegli atomi. Nel DNA, il sequenziamento viene utilizzato per trovare l’ordine in cui si verificano determinate molecole. Queste molecole sono chiamate nucleotidi. Le quattro basi nucleotidiche sono adenina, guanina, citosina e timina.
Un modo per sequenziare lunghi filamenti di DNA è utilizzare il metodo del fucile a pompa. In questo metodo, il DNA viene suddiviso in frammenti casuali. I segmenti risultanti vengono quindi sequenziati utilizzando un metodo chiamato metodo di terminazione della catena. La terminazione della catena è il metodo di scelta per brevi sequenze di DNA. Utilizza poche sostanze chimiche aggressive e quantità inferiori di radioattività rispetto ad altri metodi a sequenza breve.
Nel metodo di terminazione della catena, un filamento di DNA è diviso in quattro reazioni di sequenziamento. Ciascuno contiene tutti e quattro i nucleotidi e un enzima che funge da catalizzatore, chiamato DNA polimerasi. A ciascuna reazione di sequenziamento viene quindi aggiunto un dideossinucleotide, che è fondamentalmente un nucleotide privo di una parte della sua sequenza zuccherina. Dopo aver elaborato queste reazioni, gli scienziati sono in grado di visualizzarle e leggere la sequenza del DNA.
Durante il metodo shotgun di sequenziamento del DNA, tutto ciò accade più volte utilizzando diversi frammenti casuali di DNA. Ciò si traduce in più sezioni sovrapposte di DNA sequenziato. Un programma per computer utilizza quindi le sezioni sovrapposte per creare una sequenza di DNA continua.
Il problema con il metodo shotgun è che il DNA è incredibilmente complesso. Spesso contiene sequenze ripetitive che sembrano uguali ma provengono da parti diverse del DNA. L’insieme completo del DNA umano, chiamato genoma umano, ha più di tre miliardi di paia di basi. L’unico modo per essere sicuri che il posizionamento delle sequenze ripetitive sia corretto è eseguire più letture casuali in modo che ogni parte venga sequenziata più volte. Anche così, si verificano errori.
Il metodo di sequenziamento shotgun è stato l’avanguardia del sequenziamento del DNA fino a circa il 2005. Da allora, gli scienziati hanno creato il sequenziamento di nuova generazione, che funziona molto più velocemente. L’accuratezza delle singole letture è inferiore rispetto al sequenziamento shotgun, ma gli scienziati sono compensati dalla possibilità di eseguire più letture in meno tempo.