La focalizzazione isoelettrica (IEF), chiamata anche elettrofocalizzazione, è un mezzo per separare le molecole in base alle differenze nella loro carica elettrica. È un tipo di elettroforesi, un fenomeno in cui le particelle possono essere disperse nel fluido mediante l’applicazione di un campo elettrico costante. Nelle cellule viventi, la focalizzazione isoelettrica avviene naturalmente, ma spesso viene ricreata in laboratorio utilizzando proteine sospese in un gel.
La capacità di separare le molecole nella focalizzazione isoelettrica si basa sulla comprensione del livello di pH di diverse proteine. Le proteine possono avere un pH compreso tra 1 e 12. La carica netta di una proteina sarà determinata dal livello di pH dell’ambiente locale. Ad esempio, una proteina potrebbe avere una carica netta neutra, positiva o negativa in base al pH dell’ambiente circostante.
La carica netta di qualsiasi proteina è la somma totale delle sue cariche positive e negative. Questo è determinato dal fatto che le catene amminiche che compongono la proteina siano o meno acide o basiche. Quando ci sono più gruppi acidi che gruppi basici, il pH risultante sarà basso o acido. Quando ci sono più gruppi basici che acidi, il pH risultante sarà alto o basico. La maggior parte delle proteine avrà un pH di 3-12, con una grande concentrazione nell’intervallo 4-7.
Le proteine sono caricate positivamente quando si trovano in una soluzione che ha un valore di pH inferiore a quello della proteina stessa. Avranno una carica negativa quando il valore di pH della soluzione ha un valore di pH superiore al proprio pH. Pertanto, il livello di pH della proteina è chiamato punto isoelettrico della proteina. La focalizzazione isoelettrica si verifica quando l’ambiente della proteina viene manipolato utilizzando un campo elettrico.
Quando un campo elettrico viene applicato all’ambiente della proteina, influenzerà il comportamento delle particelle nella proteina. Ciò significa che quando la proteina è sottoposta a un ambiente che è allo stesso livello di pH di se stessa, le particelle nella proteina non si muoveranno. Quando, invece, la proteina viene sottoposta ad un ambiente che ha un pH inferiore al suo stesso, le particelle si sposteranno verso il catodo. Se l’ambiente della proteina ha un pH più alto del proprio, le particelle si sposteranno verso l’anodo. La focalizzazione isoelettrica richiede la manipolazione dell’ambiente della proteina in modo che le sue particelle si muovano nella direzione desiderata.