Le proteine sono costituite da catene di amminoacidi, ognuna delle quali ha valori di pH diversi. Il pH complessivo della proteina è composto dalla miscela dei valori di pH dei singoli amminoacidi in quanto formano ioni nella particolare soluzione in cui sono disciolti. Il punto isoelettrico (pI) di una proteina è il pH al quale quella proteina non ha carica netta. Questa proprietà può essere sfruttata per separare la proteina con il pI noto da altre proteine in una miscela eterogenea.
Gli amminoacidi hanno un gruppo amminico terminale che è basico, con un pH elevato. L’altra estremità dell’amminoacido è il terminale carbossilico che è acido, con un pH basso. A diversi valori di pH, gli amminoacidi sulle proteine varieranno nelle loro cariche. Le proteine al di sotto del loro punto isoelettrico hanno una carica positiva. Al contrario, quelli al di sopra di questo punto hanno una carica negativa.
Per sfruttare la conoscenza del punto isoelettrico per la purificazione delle proteine, una miscela di proteine viene sottoposta a un campo elettrico. Questo è comunemente fatto in gel di agarosio o poliacrilammide ed è noto come focalizzazione isoelettrica. Una tecnica più antica consiste nell’eseguire la procedura su scala più ampia in una colonna di vetro utilizzando una soluzione di saccarosio con elettrodi su ciascuna estremità. Vengono aggiunti composti chiamati anfoliti che causano la formazione di un gradiente di pH coerente. Quando il gel o la colonna sono sottoposti alla corrente elettrica, le proteine migrano fino a raggiungere il loro punto isoelettrico, per poi rimanere stazionarie.
Le proteine sui gel sono generalmente rese visibili da un colorante che lega le proteine. A volte, se si studiano gli enzimi, si può usare un substrato che dia una reazione colorata. Solitamente vengono utilizzati standard che hanno proteine di punti isoelettrici noti.
Una volta che si sa dove si trova la proteina desiderata, una tecnica comune consiste nel tagliare la proteina isolata dal gel. La proteina può quindi essere purificata e sequenziata. Una volta che la sequenza è nota, può essere utilizzata per progettare primer per la reazione a catena della polimerasi (pcr) e utilizzata per clonare il gene per la proteina se è disponibile materiale di acido nucleico adatto.
La focalizzazione isoelettrica è anche un modo comune per analizzare proteine strettamente correlate per vedere quanto sono diverse l’una dall’altra. Una complicazione può essere che alle proteine possono essere legati degli zuccheri. Questo è chiamato glicosilazione e può influenzare il pI della proteina. Può sembrare che ci siano più proteine con diversi punti isoelettrici, quando in realtà c’è solo una proteina che è stata glicosilata in modo differenziale. Le proteine purificate con metodi standard come la cromatografia vengono talvolta analizzate mediante focalizzazione isoelettrica per garantirne la purezza.