Un microscopio confocale è un particolare tipo di microscopio a fluorescenza utilizzato per ottenere immagini 2D e 3D di alta qualità. Con un microscopio fluorescente di base (ampio campo), la luce di una particolare lunghezza d’onda viene riflessa su un campione e il campione assorbe parte di quella luce e riflette il resto a una lunghezza d’onda maggiore. La luce a lunghezza d’onda maggiore passa attraverso uno specchio dicroico, che consente il passaggio della luce a lunghezza d’onda maggiore, ma non alla luce di lunghezza d’onda originale (più corta). La persona che guarda il campione vede solo la luce che è passata attraverso lo specchio dicroico. I microscopi fluorescenti di base catturano sia la luce a fuoco che quella sfocata, il che funziona bene per campioni di grandi dimensioni in cui non è richiesta una risoluzione molto elevata. Non funziona così bene per la visualizzazione di dettagli precisi. È necessario un microscopio confocale per acquisire immagini fluorescenti ad alta risoluzione.
Il microscopio confocale utilizza un foro stenopeico per respingere la luce fuori fuoco. Invece della luce che passa solo attraverso uno specchio dicroico, la luce passa sia attraverso uno specchio dicroico, sia attraverso un foro stenopeico, il che significa che la persona che guarda il campione vede solo un singolo punto del campione. Per visualizzare un intero campione, gli specchi mobili scansionano la luce su un piano rettangolare del campione e un computer raccoglie la luce emessa mentre il campione viene scansionato. Una scansione completa risulterà in una fetta ottica, o sezione trasversale, del campione. Questo tipo di microscopia è chiamata microscopia a scansione laser confocale, in parte perché un laser viene utilizzato come sorgente di luce.
Per creare un’immagine 3D, vengono eseguite diverse scansioni, creando diverse “fette” del campione e un computer combina ciascuna fetta per creare un’immagine tridimensionale. Il microscopio può essere programmato per variare lo spazio tra le fette, a seconda di quanto nitida l’immagine 3D che l’utente vuole ottenere. Il microscopio può anche variare la velocità con cui scansiona un’immagine, con una scansione lenta che fornisce una risoluzione maggiore rispetto alla scansione veloce.
Il microscopio confocale è diventato uno strumento molto comunemente usato in molti laboratori di scienze biologiche. Sono costosi, e un po’ grandi, e spesso hanno stanze dedicate al loro utilizzo, perché la stanza deve essere buia per ottenere una buona immagine fluorescente. Sebbene i microscopi confocali siano più comunemente utilizzati per visualizzare le cellule e le strutture all’interno delle cellule, possono essere utilizzati per ottenere un’immagine di qualsiasi campione fluorescente tridimensionale e talvolta sono utilizzati per visualizzare i materiali semiconduttori.