Un plasmide è un pezzo circolare di DNA che si trova in molti batteri. La caratteristica più notevole dei plasmidi è che si replicano indipendentemente dal DNA principale dell’ospite. Spesso un plasmide viene utilizzato nella tecnologia di clonazione ricombinante per clonare geni appena isolati. È anche molto comune utilizzare un plasmide ricombinante per esprimere grandi quantità di un gene noto per ottenere RNA o proteine da esso. Tale espressione genica ricombinante è stata indispensabile per l’industria biotecnologica.
I plasmidi ricombinanti sono stati sviluppati per la prima volta nel ratto da laboratorio del mondo batterico, Escherichia coli. Molti altri tipi di batteri possono ospitare tali plasmidi. Questi frammenti di DNA autoreplicanti possono trasferirsi naturalmente tra diversi tipi di batteri. Nonostante ciò, a volte era difficile introdurre i plasmidi ricombinanti in altri tipi di batteri.
La procedura principale per introdurre il DNA in altre cellule è nota come trasformazione, in cui i batteri vengono trattati con sostanze chimiche che li rendono più propensi ad assorbire DNA estraneo. Un’altra tecnica prevede di scuotere i batteri con una corrente elettrica. Questo è noto come elettroporazione.
Le ragioni per la creazione di un plasmide ricombinante variano. Spesso quando il DNA viene isolato per la prima volta da un particolare tessuto o organismo, viene trasformato in plasmidi per creare una libreria. Quindi il DNA può essere estratto da singole colonie. Successivamente, possono essere sottoposti a screening mediante sequenziamento del DNA per determinare quali tipi di geni sono presenti, se le sequenze sono presenti in un database. A volte vengono clonati geni con funzioni sconosciute.
In altri casi, il prodotto genico è ben noto, ma i ricercatori desiderano esprimerne grandi quantità per ulteriori studi. Il gene può essere clonato in plasmidi ricombinanti che sono vettori di sovraespressione. Sono progettati appositamente per produrre grandi quantità di RNA o proteine. Ciò è stato particolarmente prezioso per le proteine umane ricombinanti, che in precedenza erano spesso disponibili solo dai cadaveri, rendendo molto difficile lo studio della funzione di un particolare gene.
Diversi fattori sono coinvolti nella costruzione di un plasmide che può essere utilizzato nella clonazione molecolare. Il plasmide deve avere un marker selezionabile. Ciò rende possibile selezionare una cellula con il gene. Normalmente, la popolazione di cellule prive del gene con il marcatore supera di gran lunga la quantità di cellule che lo portano. Generalmente un plasmide ricombinante ha resistenza ad un antibiotico, oppure può crescere in assenza di un particolare amminoacido.
Un tale plasmide ha bisogno di un’origine di replicazione in modo che possa iniziare a sintetizzare il suo DNA ricombinante. Inoltre, un plasmide ricombinante richiede una serie di sequenze speciali per consentire a un enzima di restrizione di scindere il DNA per consentire l’inserimento di un gene nel vettore di clonazione. Esiste un gran numero di enzimi di restrizione altamente specializzati per specifiche sequenze di DNA che devono essere presenti dove inizia e finisce il gene.
I ceppi tradizionali di batteri sono stati usati per decenni per la clonazione del DNA. Inoltre, ci sono nuovi kit che utilizzano ceppi batterici appositamente costruiti per facilitare la sovraespressione del prodotto genico. Combinano la tecnologia per la clonazione di un gene con un metodo che consente una facile purificazione della proteina espressa dal gene una volta che è stata clonata nel plasmide ricombinante.