Uno spettrofotometro è uno degli strumenti scientifici che si trovano comunemente in molti laboratori di ricerca e industriali. Gli spettrofotometri sono utilizzati per la ricerca nei laboratori di fisica, biologia molecolare, chimica e biochimica. Tipicamente, il nome si riferisce alla spettroscopia ultravioletta-visibile (UV-Vis).
L’energia della luce dipende dalla sua lunghezza d’onda, solitamente indicata come lambda. Sebbene lo spettro elettromagnetico si estenda su una vasta gamma di lunghezze d’onda, la maggior parte dei laboratori può misurarne solo una piccola frazione. La spettroscopia UV-Vis misura tra 200 e 400 nanometri (nm) per le misurazioni della luce UV e fino a circa 750 nm nello spettro visibile.
Per la spettroscopia UV-Vis, i campioni sono generalmente contenuti e misurati in piccoli contenitori chiamati cuvette. Questi possono essere di plastica se utilizzati nello spettro visibile, ma devono essere quarzo o silice fusa se utilizzati per misurazioni UV. Ci sono alcune macchine che possono utilizzare provette di vetro.
La spettroscopia visibile viene spesso utilizzata a livello industriale per la colorimetria. Utilizzando questo metodo, i campioni vengono misurati a più lunghezze d’onda da 400-700 nm e i loro profili di assorbanza vengono confrontati con uno standard. Questa tecnica è spesso utilizzata dai produttori di tessuti e inchiostri. Altri utenti commerciali della spettroscopia UV-Vis includono laboratori forensi e stampanti.
Nella ricerca biologica e chimica, le soluzioni vengono spesso quantificate misurando il loro grado di assorbimento della luce a una particolare lunghezza d’onda. Un valore chiamato coefficiente di estinzione viene utilizzato per calcolare la concentrazione del composto. Ad esempio, i laboratori di biologia molecolare utilizzano spettrofotometri per misurare le concentrazioni di campioni di DNA o RNA. A volte hanno una macchina avanzata chiamata spettrofotometro NanoDrop™ che utilizza una frazione della quantità di campione rispetto a quella utilizzata dagli spettrofotometri tradizionali.
Affinché la quantificazione sia valida, il campione deve rispettare la legge Beer-Lambert. Ciò richiede che l’assorbanza sia direttamente proporzionale alla lunghezza del percorso della cuvetta e all’assorbimento del composto. Sono disponibili tabelle dei coefficienti di estinzione per molti, ma non tutti, i composti.
Molte reazioni chimiche ed enzimatiche cambiano colore nel tempo e gli spettrofotometri sono molto utili per misurare questi cambiamenti. Ad esempio, gli enzimi della polifenolo ossidasi che causano l’imbrunimento della frutta ossidano le soluzioni di composti fenolici, trasformando le soluzioni limpide in soluzioni visibilmente colorate. Tali reazioni possono essere saggiate misurando l’aumento dell’assorbanza al variare del colore. Idealmente, il tasso di variazione sarà lineare e si possono calcolare i tassi da questi dati. Uno spettrofotometro più avanzato avrà un portacuvette a temperatura controllata per eseguire le reazioni a una temperatura precisa ideale per l’enzima.
I laboratori di microbiologia e biologia molecolare utilizzano spesso uno spettrofotometro per misurare la crescita di colture di batteri. Gli esperimenti di clonazione del DNA vengono spesso eseguiti nei batteri e i ricercatori devono misurare lo stadio di crescita della coltura per sapere quando eseguire determinate procedure. Misurano l’assorbanza, nota come densità ottica (OD), su uno spettrofotometro. Si può dire dall’OD se i batteri si stanno attivamente dividendo o se stanno iniziando a morire.
Gli spettrofotometri utilizzano una sorgente luminosa per illuminare una serie di lunghezze d’onda attraverso un monocromatore. Questo dispositivo trasmette quindi una banda stretta di luce e lo spettrofotometro confronta l’intensità della luce che passa attraverso il campione con quella che passa attraverso un composto di riferimento. Ad esempio, se un composto viene sciolto in etanolo, il riferimento sarebbe l’etanolo. Il risultato viene visualizzato come grado di assorbanza della differenza tra loro. Questo indica l’assorbanza del composto campione.
La ragione di questa assorbanza è che sia la luce ultravioletta che quella visibile hanno energia sufficiente per eccitare le sostanze chimiche a livelli di energia maggiori. Questa eccitazione si traduce in una lunghezza d’onda più alta, che è visibile quando l’assorbanza viene tracciata rispetto alla lunghezza d’onda. Diverse molecole o composti inorganici assorbono energia a diverse lunghezze d’onda. Quelli con il massimo assorbimento nell’intervallo visibile sono visti come colorati dall’occhio umano.
Le soluzioni dei composti possono essere chiare, ma assorbono nell’intervallo UV. Tali composti di solito hanno doppi legami o anelli aromatici. A volte ci sono uno o più picchi rilevabili quando il grado di assorbimento viene tracciato rispetto alla lunghezza d’onda. In tal caso, ciò può aiutare nell’identificazione di alcuni composti confrontando la forma del grafico con quella dei grafici di riferimento noti.
Esistono due tipi di spettrofotometri UV-Vis, a raggio singolo e doppio raggio. Questi differiscono nel modo in cui misurano l’intensità della luce tra il campione di riferimento e quello di prova. Le macchine a doppio raggio misurano contemporaneamente il composto di riferimento e di prova, mentre le macchine a raggio singolo misurano prima e dopo l’aggiunta del composto di prova.