Die Durchflusszytometrie ist die Untersuchung einzelner Zellen, während sie einen Flüssigkeitsstrom passieren. Bestandteile der Zelle, entweder im Inneren oder auf der Oberfläche, müssen zuerst mit einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Ein Laser in einem Instrument namens Durchflusszytometer regt diese fluoreszierenden Moleküle so an, dass sie Licht mit verschiedenen Wellenlängen emittieren. Die Menge der Fluoreszenz kann einen Hinweis darauf geben, wie viel Prozent der verschiedenen Zelltypen in der Probe vorhanden sind. Die Durchflusszytometrie wird in Labors für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt, darunter Krebsforschung, Immunologie und Zellzyklusanalyse.
Um eine durchflusszytometrische Analyse durchzuführen, muss eine Suspension einzelner Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt werden, was entweder in einem einstufigen oder zweistufigen Verfahren erfolgen kann. Zelluläre Proteine werden oft unter Verwendung von Antikörpern gefärbt, die gegen das interessierende Protein gerichtet sind. In einem einstufigen Verfahren werden Zellen mit Antikörpern gefärbt, die bereits mit Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Wenn keine markierten Antikörper verfügbar sind, können die Zellen zuerst mit einem unmarkierten Primärantikörper und dann mit einem fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper gefärbt werden.
Sobald die Zellen markiert sind, sind sie für die Durchflusszytometrie-Analyse bereit. Ein die Zellsuspension enthaltendes Röhrchen wird auf das Durchflusszytometer geladen. Die Zellen fließen durch das Instrument und passieren einen Laser in einer Reihe. Wenn der Laser auf jede Zelle trifft, wird das Licht in Vorwärts- oder Seitenrichtung gestreut. Vorwärtsstreuungsmessungen geben einen Hinweis auf die Zellgröße, während die Seitenstreuung ein Maß für die Granularität der Zellen ist.
Die Energie des Lasers regt auch die Fluorochrom-Moleküle an, den Fluoreszenzfarbstoff, der zum Färben der Zellen verwendet wird. Ein gebräuchlicher Laser für die Durchflusszytometrie ist der Argon-Ionen-Laser, der Licht mit einer Wellenlänge von 488 Nanometern (nm) emittiert. Dieses Licht regt die Moleküle des grünen Farbstoffs Fluorescein an, der dann Licht mit einer Wellenlänge von 525 nm emittiert. Photomultiplier-Röhrchen (PMTs) im Durchflusszytometer verfügen über Lichtfilter, die das von den verschiedenen Fluorochromen emittierte Licht erkennen. Das Instrument kann über mehrere PMTs verfügen, die Licht mit unterschiedlichen Wellenlängen erkennen.
Rot-Diode, Violett-Diode oder He-Ne (Helium-Neon) sind andere Laser, die in einem Durchflusszytometer verwendet werden können. Andere Fluorochrome, die in der Durchflusszytometrie-Analyse verwendet werden, umfassen Phycoerythrin, Texas-Rot oder Allophycocyanin. Verschiedene Kombinationen von Lasern und Fluorochromen ermöglichen es dem Forscher, im selben Experiment Informationen über viele verschiedene Zellmarker zu sammeln.
Software, die für die Verwendung mit dem Durchflusszytometer entwickelt wurde, unterstützt den Forscher bei der Visualisierung der Daten. Zellpopulationen werden unter Verwendung von Punktdiagrammen, Dichtediagrammen oder Histogrammen analysiert. Um die interessierenden Zellen können Bereiche gezogen werden, und die Fluoreszenzintensität kann einen Hinweis auf Prozentsätze verschiedener Zellen in der Probe geben.