Der Phosphorylierungsgrad von organischen Molekülen oder Substanzen wird mit zwei Methoden bestimmt: Western Blotting und Massenspektrometrie. Phosphorylierung bezieht sich am häufigsten auf die Bindung eines Phosphats an ein Protein. Wenn Phosphate an Proteine binden, werden die natürlichen Prozesse und Funktionen von Proteinenzymen im menschlichen Körper gestört. Die Bestimmung des Phosphorylierungsniveaus ist entscheidend für die Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten, von Krebs bis Diabetes.
Western Blotting ist eine beliebte Methode zur Bestimmung des Phosphorylierungsgrads eines bestimmten Proteinsatzes. Antikörper wie monoklonale Anti-Phospho-Tyrosin-Antikörper werden typischerweise verwendet, weil sie leicht an Tyrosinreste eines Proteins binden, die durch Phosphorylierung beeinflusst werden. Beim Western-Blotting werden die Proteine zunächst nach Größe getrennt, wobei eine elektrische Ladungsmethode, die als Gelelektrophorese bekannt ist, verwendet wird.
Die Proteine werden dann auf eine Membran übertragen, die mit speziellen Antikörpern bedeckt ist, die an Phosphate auf Proteinen binden. Sobald die Proteine übertragen sind, haften die Antikörper an allen Proteinen mit einem angehängten Phosphat. Der Phosphorylierungsgrad kann dann durch eine Röntgenaufnahme der Membran bestimmt werden. Alle betroffenen Proteine geben einen Lichtblitz ab, der es dem Forscher erleichtert, den Phosphorylierungsspiegel zu messen.
Massenspektrometrie ist eine weitere Möglichkeit, den Phosphorylierungsgrad einer Substanz zu messen. Dieser Prozess wandelt die Proteinmoleküle in Ionen um, wodurch sie leichter verfolgt und gemessen werden können. Die Probe wird durch eine leistungsstarke Ionenquelle ionisiert, die die Probe mit Elektronen überschwemmt. Diese Aktion verwandelt die Probe in Kationen, positiv geladene Ionen.
Der Massenanalysator des Massenspektrometers trennt die Ionen nach ihrer Masse und Ladungsintensität. Auf diese Weise kann der Forscher das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis ermitteln, das für die Ermittlung des Phosphorylierungsgrads der Probe entscheidend ist. Schließlich misst der Detektor die Ionen, damit die Daten in Diagrammform angezeigt werden können. Das Diagramm zeigt das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis der Ionen auf der x-Achse und die relative Intensität der Ionen auf der y-Achse.
Die Phosphorylierungsgrade können auch während der Substratphosphorylierung gemessen werden. Die Substratphosphorylierung ist ein Prozess, der während der Glykolyse Adenosintriphosphat (ATP) erzeugt, ein Molekül, das für den Energietransfer zwischen Zellen entscheidend ist. Dieser Prozess findet sowohl in tierischen Zellen als auch in Pflanzenzellen statt.
In Pflanzenzellen werden ATP-Moleküle durch die Nutzung von Sonnenenergie gebildet. Diese Energie fördert die Phosphorylierung in den Chloroplasten der Pflanze, dem Ort der Pflanzenphotosynthese. Der Phosphorylierungsgrad korreliert mit der Phosphatmenge, die benötigt wird, um zusätzliche ATP-Moleküle zu erzeugen.