Proteine sind aus Aminosäureketten aufgebaut, die jeweils unterschiedliche pH-Werte haben. Der Gesamt-pH-Wert des Proteins setzt sich aus der Mischung der pH-Werte der einzelnen Aminosäuren zusammen, wenn sie in der jeweiligen Lösung, in der sie gelöst sind, Ionen bilden. Der isoelektrische Punkt (pI) eines Proteins ist der pH-Wert, bei dem dieses Protein keine Nettoladung hat. Diese Eigenschaft kann ausgenutzt werden, um das Protein mit dem bekannten pI von anderen Proteinen in einem heterogenen Gemisch zu trennen.
Aminosäuren haben eine basische Amino-Endgruppe mit einem hohen pH-Wert. Das andere Ende der Aminosäure ist das Carboxyl-Ende, das sauer ist und einen niedrigen pH-Wert hat. Bei unterschiedlichen pH-Werten variieren die Aminosäuren auf den Proteinen in ihrer Ladung. Proteine unterhalb ihres isoelektrischen Punktes haben eine positive Ladung. Im Gegensatz dazu haben diejenigen über diesem Punkt eine negative Ladung.
Um die Kenntnis des isoelektrischen Punktes für die Proteinreinigung zu nutzen, wird ein Proteingemisch einem elektrischen Feld ausgesetzt. Dies wird üblicherweise in Agarose- oder Polyacrylamidgelen durchgeführt und ist als isoelektrische Fokussierung bekannt. Eine ältere Technik besteht darin, das Verfahren in größerem Maßstab in einer Glassäule unter Verwendung einer Saccharoselösung mit Elektroden an jedem Ende durchzuführen. Es werden Ampholyte genannte Verbindungen zugesetzt, die die Bildung eines konsistenten pH-Gradienten bewirken. Wenn das Gel oder die Säule dem elektrischen Strom ausgesetzt wird, wandern die Proteine, bis sie ihren isoelektrischen Punkt erreichen und bleiben dann stationär.
Proteine auf Gelen werden im Allgemeinen durch einen Farbstoff sichtbar gemacht, der Proteine bindet. Wenn Enzyme untersucht werden, kann manchmal ein Substrat verwendet werden, das eine farbige Reaktion auslöst. Üblicherweise werden Standards verwendet, die Proteine mit bekannten isoelektrischen Punkten aufweisen.
Sobald man weiß, wo sich das gewünschte Protein befindet, besteht eine übliche Technik darin, das isolierte Protein aus dem Gel herauszuschneiden. Das Protein kann dann gereinigt und sequenziert werden. Sobald die Sequenz bekannt ist, kann sie verwendet werden, um Primer für die Polymerase-Kettenreaktion (pcr) zu entwerfen und verwendet werden, um das Gen für das Protein zu klonen, wenn geeignetes Nukleinsäurematerial verfügbar ist.
Isoelektrische Fokussierung ist auch eine gängige Methode, um eng verwandte Proteine zu analysieren, um zu sehen, wie unterschiedlich sie sich voneinander unterscheiden. Eine Komplikation kann sein, dass an Proteine Zucker gebunden sein können. Dies wird als Glykosylierung bezeichnet und kann den pI des Proteins beeinflussen. Es mag so aussehen, als gäbe es mehrere Proteine mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten, obwohl es in Wirklichkeit nur ein Protein gibt, das unterschiedlich glykosyliert wurde. Durch Standardverfahren wie Chromatographie gereinigte Proteine werden manchmal durch isoelektrische Fokussierung analysiert, um ihre Reinheit sicherzustellen.