Ein Plasmid ist ein zirkuläres DNA-Stück, das in vielen Bakterien vorkommt. Das bemerkenswerteste Merkmal von Plasmiden ist, dass sie sich unabhängig von der Haupt-DNA des Wirts replizieren. In der rekombinanten Klonierungstechnologie wird häufig ein Plasmid verwendet, um neu isolierte Gene zu klonen. Es ist auch sehr üblich, ein rekombinantes Plasmid zu verwenden, um große Mengen eines bekannten Gens zu exprimieren, um daraus RNA oder Protein zu erhalten. Eine solche rekombinante Genexpression ist für die biotechnologische Industrie unverzichtbar.
Rekombinante Plasmide wurden zuerst in der Laborratte der Bakterienwelt, Escherichia coli, entwickelt. Viele andere Bakterienarten können solche Plasmide beherbergen. Diese Stücke selbstreplizierender DNA können auf natürliche Weise zwischen verschiedenen Bakterienarten übertragen werden. Trotzdem war es manchmal schwierig, die rekombinanten Plasmide in andere Bakterienarten einzuführen.
Das primäre Verfahren zum Einbringen von DNA in andere Zellen ist als Transformation bekannt, bei dem die Bakterien mit Chemikalien behandelt werden, die es ihnen wahrscheinlicher machen, fremde DNA aufzunehmen. Eine andere Technik besteht darin, die Bakterien mit elektrischem Strom zu schocken. Dies wird als Elektroporation bezeichnet.
Die Gründe für die Herstellung eines rekombinanten Plasmids variieren. Wenn DNA zum ersten Mal aus einem bestimmten Gewebe oder Organismus isoliert wird, wird sie oft in Plasmide transformiert, um eine Bibliothek zu erstellen. Dann kann DNA aus einzelnen Kolonien extrahiert werden. Als nächstes können sie durch DNA-Sequenzierung gescreent werden, um zu bestimmen, welche Arten von Genen vorhanden sind, wenn die Sequenzen in einer Datenbank vorhanden sind. Manchmal werden Gene mit unbekannten Funktionen geklont.
In anderen Fällen ist das Genprodukt bekannt, aber die Forscher wollen große Mengen davon für weitere Untersuchungen exprimieren. Das Gen kann in rekombinante Plasmide kloniert werden, die Überexpressionsvektoren sind. Sie wurden speziell entwickelt, um große Mengen an RNA oder Protein zu produzieren. Dies ist besonders wertvoll für rekombinante menschliche Proteine, die früher oft nur von Kadavern erhältlich waren, was es sehr schwierig macht, die Funktion eines bestimmten Gens zu untersuchen.
Mehrere Faktoren sind an der Konstruktion eines Plasmids beteiligt, das beim molekularen Klonen verwendet werden kann. Das Plasmid muss einen selektierbaren Marker aufweisen. Dadurch ist es möglich, eine Zelle mit dem Gen auszuwählen. Normalerweise übertrifft die Population von Zellen, denen das Gen mit dem Marker fehlt, die Anzahl der Zellen, die es tragen. Im Allgemeinen weist ein rekombinantes Plasmid Resistenz gegen ein Antibiotikum auf oder kann in Abwesenheit einer bestimmten Aminosäure wachsen.
Ein solches Plasmid benötigt einen Replikationsursprung, damit es mit der Synthese seiner rekombinanten DNA beginnen kann. Außerdem erfordert ein rekombinantes Plasmid einen Satz spezieller Sequenzen, damit ein Restriktionsenzym die DNA spalten kann, um die Insertion eines Gens in den Klonierungsvektor zu ermöglichen. Es gibt eine Vielzahl von Restriktionsenzymen, die auf bestimmte DNA-Sequenzen spezialisiert sind, die dort vorhanden sein müssen, wo das Gen beginnt und endet.
Traditionelle Bakterienstämme werden seit Jahrzehnten zum Klonen von DNA verwendet. Darüber hinaus gibt es neue Kits, die speziell konstruierte Bakterienstämme verwenden, um die Überexpression des Genprodukts zu erleichtern. Sie kombinieren die Technologie zum Klonen eines Gens mit einer Methode, die eine einfache Reinigung des vom Gen exprimierten Proteins ermöglicht, sobald es in das rekombinante Plasmid kloniert wurde.