El nivel de fosforilación de moléculas o sustancias orgánicas se determina mediante dos métodos: Western Blot y espectrometría de masas. La fosforilación se refiere con mayor frecuencia a la unión de un fosfato a una proteína. Cuando los fosfatos se adhieren a los protiens, los procesos naturales y las funciones de las enzimas proteicas dentro del cuerpo humano se alteran. Determinar el nivel de fosforilación es fundamental para tratar una amplia gama de enfermedades, desde el cáncer hasta la diabetes.
La transferencia Western es un método popular utilizado para determinar el nivel de fosforilación de un conjunto particular de proteínas. Los anticuerpos tales como los anticuerpos monoclonales anti-fosfotirosina se usan típicamente porque se unen fácilmente a los residuos de tirosina de una proteína, que se ven afectados por la fosforilación. En la transferencia Western, las proteínas se separan primero por tamaño utilizando un método de carga eléctrica conocido como electroforesis en gel.
Luego, las proteínas se transfieren a una membrana que se ha cubierto con anticuerpos especiales que se unen a los fosfatos de las proteínas. Una vez que se transfieren las proteínas, los anticuerpos se adhieren a cualquier proteína con un fosfato adherido. El nivel de fosforilación puede determinarse luego mediante una radiografía de la membrana. Cualquier proteína afectada emitirá un destello de luz, lo que facilitará al investigador medir los niveles de fosforilación.
La espectrometría de masas es otra forma de medir el nivel de fosforilación de una sustancia. Este proceso convierte las moléculas de proteína en iones, lo que facilita su seguimiento y medición. La muestra es ionizada por una fuente de iones de alta potencia que inunda la muestra con electrones. Esta acción convierte la muestra en cationes, iones con carga positiva.
El analizador de masas del espectrómetro de masas separa los iones por su masa e intensidad de carga. Esto permite al investigador descubrir la relación masa-carga, que es fundamental para descubrir el nivel de fosforilación de la muestra. Finalmente, el detector mide los iones en orden para que los datos se puedan mostrar en forma de gráfico. El gráfico muestra la relación masa-carga de los iones en el eje xy la intensidad relativa de los iones en el eje y.
Los niveles de fosforilación también se pueden medir durante la fosforilación del sustrato. La fosforilación del sustrato es un proceso que crea trifosfato de adenosina (ATP), una molécula fundamental para la transferencia de energía entre las células, durante la glucólisis. Este proceso ocurre tanto en células animales como en células vegetales.
En las células vegetales, las moléculas de ATP se crean utilizando energía del sol. Esta energía estimula la fosforilación en los cloroplastos de la planta, el sitio de la fotosíntesis de la planta. El nivel de fosforilación se correlaciona con la cantidad de fosfato necesaria para crear moléculas de ATP adicionales.