Les protéines sont constituées de chaînes d’acides aminés, dont chacun a des valeurs de pH différentes. Le pH global de la protéine est composé du mélange des valeurs de pH des acides aminés individuels au fur et à mesure qu’ils forment des ions dans la solution particulière dans laquelle ils sont dissous. Le point isoélectrique (pI) d’une protéine est le pH auquel cette protéine n’a pas de charge nette. Cette propriété peut être exploitée pour séparer la protéine avec le pI connu d’autres protéines dans un mélange hétérogène.
Les acides aminés ont un groupe amino terminal qui est basique, ayant un pH élevé. L’autre extrémité de l’acide aminé est le carboxyle terminal qui est acide, avec un pH bas. À des valeurs de pH différentes, les acides aminés sur les protéines varieront dans leurs charges. Les protéines en dessous de leur point isoélectrique ont une charge positive. En revanche, ceux au-dessus de ce point ont une charge négative.
Pour exploiter la connaissance du point isoélectrique pour la purification des protéines, un mélange de protéines est soumis à un champ électrique. Cela se fait généralement dans des gels d’agarose ou de polyacrylamide, et est connu sous le nom de focalisation isoélectrique. Une technique plus ancienne consiste à effectuer la procédure à plus grande échelle dans une colonne de verre en utilisant une solution de saccharose avec des électrodes à chaque extrémité. Des composés appelés ampholytes sont ajoutés qui provoquent la formation d’un gradient de pH constant. Lorsque le gel ou la colonne est soumis au courant électrique, les protéines migrent jusqu’à atteindre leur point isoélectrique, puis restent stationnaires.
Les protéines sur gels sont généralement rendues visibles par un colorant qui lie les protéines. Parfois, si des enzymes sont étudiées, un substrat peut être utilisé qui donne une réaction colorée. Habituellement, des normes sont utilisées qui ont des protéines de points isoélectriques connus.
Une fois que l’on sait où se trouve la protéine souhaitée, une technique courante consiste à couper la protéine isolée du gel. La protéine peut ensuite être purifiée et séquencée. Une fois que la séquence est connue, elle peut être utilisée pour concevoir des amorces pour la réaction en chaîne par polymérase (pcr) et utilisée pour cloner le gène de la protéine si un matériel d’acide nucléique approprié est disponible.
La focalisation isoélectrique est également un moyen courant d’analyser des protéines étroitement liées pour voir à quel point elles sont différentes les unes des autres. Une complication peut être que les protéines peuvent contenir des sucres. C’est ce qu’on appelle la glycosylation et peut affecter le pi de la protéine. Il peut sembler qu’il existe plusieurs protéines avec des points isoélectriques différents, alors qu’en fait, il n’y a qu’une seule protéine qui a été différemment glycosylée. Les protéines purifiées par des méthodes standard telles que la chromatographie sont parfois analysées par focalisation isoélectrique pour garantir leur pureté.