Isoelektrische Fokussierung (IEF), auch Elektrofokussierung genannt, ist ein Mittel zur Trennung von Molekülen aufgrund der Unterschiede ihrer elektrischen Ladung. Es ist eine Art Elektrophorese, ein Phänomen, bei dem Partikel durch Anlegen eines konstanten elektrischen Felds in einer Flüssigkeit dispergiert werden können. In lebenden Zellen tritt die isoelektrische Fokussierung auf natürliche Weise auf, wird jedoch häufig im Labor mithilfe von in einem Gel suspendierten Proteinen nachgebildet.
Die Fähigkeit, Moleküle bei der isoelektrischen Fokussierung zu trennen, basiert auf dem Verständnis des pH-Werts verschiedener Proteine. Proteine können einen pH-Wert zwischen 1 und 12 haben. Die Nettoladung eines Proteins wird durch den pH-Wert der lokalen Umgebung bestimmt. Beispielsweise könnte ein Protein basierend auf dem pH-Wert der Umgebung eine neutrale, positive oder negative Nettoladung aufweisen.
Die Nettoladung eines Proteins ist die Summe seiner positiven und negativen Ladungen. Dies wird dadurch bestimmt, ob die Aminoketten, aus denen das Protein besteht, sauer oder basisch sind oder nicht. Wenn mehr saure Gruppen als basische Gruppen vorhanden sind, ist der resultierende pH-Wert niedrig oder sauer. Wenn mehr basische Gruppen als saure Gruppen vorhanden sind, ist der resultierende pH-Wert hoch oder basisch. Die meisten Proteine haben einen pH-Wert von 3-12, mit einer hohen Konzentration im Bereich von 4-7.
Proteine sind positiv geladen, wenn sie sich in einer Lösung befinden, deren pH-Wert niedriger ist als der des Proteins selbst. Sie sind negativ geladen, wenn der pH-Wert der Lösung einen höheren pH-Wert als ihr eigener pH-Wert hat. Daher wird der pH-Wert des Proteins als isoelektrischer Punkt des Proteins bezeichnet. Isoelektrische Fokussierung tritt auf, wenn die Umgebung des Proteins mit einem elektrischen Feld manipuliert wird.
Wenn ein elektrisches Feld an die Umgebung des Proteins angelegt wird, beeinflusst es das Verhalten der Partikel im Protein. Dies bedeutet, dass sich die Partikel im Protein nicht bewegen, wenn das Protein einer Umgebung ausgesetzt wird, die den gleichen pH-Wert wie es hat. Wenn das Protein jedoch einer Umgebung ausgesetzt wird, die einen niedrigeren pH-Wert hat als es selbst, bewegen sich die Partikel in Richtung der Kathode. Wenn die Umgebung des Proteins einen höheren pH-Wert hat als seine eigene, bewegen sich die Partikel in Richtung der Anode. Die isoelektrische Fokussierung erfordert die Manipulation der Umgebung des Proteins, damit sich seine Partikel in die gewünschte Richtung bewegen.