Hay cientos de métodos diferentes para determinar la concentración de proteínas. La increíble diversidad en los tipos de soluciones de proteínas que analizan los bioquímicos es la razón por la que no existe un método universal único que funcione para cada tipo de solución de proteínas. Los ensayos de proteínas más comunes son el ensayo de Bradford, el ensayo de Lowry y el ensayo del ácido bicinconínico. Sin embargo, se han desarrollado innumerables variaciones según sea necesario para solucionar cualquier incompatibilidad química potencial entre la solución de proteína y los reactivos que se utilizan en el ensayo.
En términos generales, existen dos categorías principales de ensayos para la determinación de la concentración de proteínas. En el primer grupo de métodos, se agrega un tinte de color o fluorescente a una solución de proteína y se une específicamente a la proteína. El tinte unido tiene una longitud de onda de absorción única que es proporcional a la cantidad de proteína. Usando un espectrómetro, es posible estimar la concentración de proteína.
El segundo grupo de ensayos implica la adición de iones de cobre (II) a una solución de proteína, donde estos iones se reducen a iones de cobre (I). Estos iones reducidos pueden formar complejos coloridos al unirse a proteínas. Al medir las absorbancias en sus longitudes de onda únicas, también se pueden inferir las concentraciones de proteínas.
Uno de los métodos más populares de determinación de la concentración de proteínas es el ensayo de Bradford. En este ensayo, se agrega un tinte rojo llamado azul brillante de Coomassie a una solución de proteína en condiciones ácidas. A medida que este tinte se une a la proteína, forma un complejo azul permanente con una absorbancia característica de 595 nanómetros.
A pesar de la versatilidad general del ensayo de Bradford, es incompatible con algunas soluciones de proteínas. En particular, el ensayo de Bradford se ve interrumpido por la presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS), un detergente que se usa comúnmente para purificar proteínas y descomponer las células por lisis. Este detergente interfiere con la unión del tinte a las proteínas, lo que da como resultado una lectura de absorción poco confiable e inexacta. Por tanto, se deben utilizar otros tipos de métodos cuando hay SDS.
Se ha desarrollado otra serie de ensayos de proteínas y todos implican una variación de la prueba de Biuret. En esta reacción, una proteína se combina con una base acuosa e iones de cobre (II). Estos iones son reducidos y luego quelados por proteínas para formar complejos coloridos. Dos ensayos que utilizan esta prueba son el ensayo de Lowry y el ensayo del ácido bicinconínico.
Con el ensayo de Lowry, se agrega un reactivo de Folin-Ciocalteu a la prueba de Biuret. El reactivo de Folin-Ciocalteu oxida los residuos aromáticos, particularmente el triptófano, y ayuda al complejo a absorber fuertemente a 750 nanómetros. El ensayo de ácido bicinconínico, por otro lado, implica la adición de ácido bicinconínico a la prueba de Biuret. Después de una breve incubación a aproximadamente 104 ° Fahrenheit (40 ° Celsius), dos equivalentes de ácido y los enlaces peptídicos de la proteína quelan un solo ion de cobre (I). El resultado es un complejo que absorbe fuertemente a 562 nanómetros.
Al seleccionar un método para la determinación de la concentración de proteínas, es importante considerar los diferentes grupos funcionales químicos presentes en la solución. La presencia de ciertas cadenas laterales de aminoácidos, enlaces disulfuro y cofactores puede hacer que la determinación de la concentración de proteínas sea tremendamente inexacta. A menudo es necesario considerar no solo las proteínas, sino también otros reactivos y tampones, como agentes reductores y detergentes. El método ideal será químicamente compatible, además de fiable, económico y sencillo de configurar.