L’absorbance du spectrophotomètre fait référence à la quantité de lumière absorbée par une solution, telle que mesurée par un instrument de laboratoire appelé spectrophotomètre à absorbance. En chimie et en biologie, les spectrophotomètres sont utilisés à diverses fins. Ils peuvent aider à identifier des composés, à déterminer les concentrations de solutions ou à estimer le nombre de cellules en suspension dans un liquide. Les spectrophotomètres fonctionnent en dirigeant un ensemble filtré de certaines longueurs d’onde de lumière à travers une solution échantillon et sur un luxmètre. La quantité de lumière transmise ou absorbée par l’échantillon, ainsi que les longueurs d’onde absorbées, révèlent certaines des propriétés de l’échantillon.
La lumière que les êtres humains perçoivent visuellement est une forme d’énergie, un rayonnement électromagnétique, et comprend une gamme de longueurs d’onde sur une petite partie du spectre électromagnétique. Les rayons gamma, les rayons X et d’autres longueurs d’onde courtes inférieures à 400 nanomètres (nm) ne sont pas visibles à l’œil humain, de même que les longueurs d’onde supérieures à 700 nm, telles que la lumière infrarouge ou les ondes radio. Les couleurs que les humains perçoivent vont des ondes bleues et violettes plus courtes autour de 400 nm à travers l’arc-en-ciel au rouge, qui est plus proche de 700 nm. Les spectrophotomètres mesurent dans le domaine visible avec un certain chevauchement dans les sections ultraviolette et infrarouge du spectre.
Lorsque nous voyons une couleur, par exemple une feuille verte, nous voyons les longueurs d’onde lumineuses qui sont transmises par cet élément. Dans le cas de la feuille verte, un composé dans les cellules de la plante appelé chlorophylle absorbe les longueurs d’onde bleues et rouges de la lumière blanche du soleil, mais n’absorbe pas fortement le vert. Au lieu de cela, les longueurs d’onde vertes et presque vertes sont transmises et la plante apparaît verte.
Dans une solution liquide donnée, certaines longueurs d’onde de la lumière seront absorbées en plus grande quantité que d’autres. Les spectrophotomètres dirigent un faisceau de lumière blanche à travers la solution échantillon étudiée. L’absorbance du spectrophotomètre est la quantité de lumière absorbée par le composé à l’étude. Cette lumière est absorbée en quantités variables sur une gamme de longueurs d’onde connue sous le nom de spectre d’absorption.
Le spectre d’absorption peut aider à identifier le composé échantillon. Par exemple, certains pigments végétaux absorbent des longueurs d’onde différentes de celles de la chlorophylle et peuvent être différenciés les uns des autres par leurs tracés d’absorption – des graphiques où l’absorbance du spectrophotomètre est affichée en fonction de la longueur d’onde. Les longueurs d’onde qui sont absorbées dans la plus grande quantité apparaîtront sous forme de pointes sur le graphique, donnant au graphique de chaque composé une forme caractéristique.
La concentration d’une solution peut également être déduite de son absorbance au spectrophotomètre. Cela se fait par la loi de Lambert-Beer, également connue sous le nom de loi de Beer, qui est une équation reliant le niveau d’absorbance du spectrophotomètre à la concentration par le biais de deux autres facteurs : le coefficient d’extinction et la longueur du trajet ou la largeur du tube d’échantillon. Le coefficient d’extinction est un facteur chimique différent pour chaque composé, mais il peut être déterminé en testant un échantillon de concentration connue dans le spectrophotomètre. La loi de Beer peut alors être utilisée pour résoudre des concentrations inconnues du même composé.