Un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) è un test eseguito in un laboratorio di immunologia per determinare i livelli di proteine in un campione biologico. Il rilevamento ELISA si riferisce alla fase finale del test in cui una soluzione limpida, o substrato, viene aggiunta a una piastra di plastica contenente un anticorpo marcato con enzima legato. L’enzima scinde il substrato e si verifica un cambiamento di colore. L’assorbanza della luce della soluzione colorata finale viene quindi misurata su un lettore di piastre ELISA o uno spettrofotometro.
Esistono vari tipi di test ELISA, i due più comuni sono l’ELISA indiretto e l’ELISA a cattura, o sandwich. L’ELISA indiretto viene utilizzato per rilevare una proteina, nota come anticorpo, nel siero di un paziente. Un esempio di test ELISA indiretto è il test del virus dell’immunodeficienza umana (HIV) utilizzato per rilevare gli anticorpi contro l’HIV. Il test sandwich ELISA rileva una proteina, o antigene, catturandola tra due anticorpi. La rilevazione dell’ormone gonadotropina corionica umana (hCG), che è elevata durante la gravidanza, viene eseguita con un test ELISA a sandwich.
Entrambi i test hanno una fase di rilevamento ELISA alla fine del test. Questo passaggio comporta l’aggiunta di un anticorpo a cui è collegata una molecola enzimatica. Dopo l’aggiunta dell’anticorpo marcato con l’enzima, viene aggiunta una soluzione incolore, contenente la molecola di substrato specifica per quell’enzima. L’enzima scinde la molecola del substrato e la soluzione cambia colore a seconda della combinazione utilizzata. La determinazione della quantità di anticorpo o antigene nel campione del paziente viene effettuata misurando l’intensità del cambiamento di colore.
Sono disponibili diverse combinazioni di substrati enzimatici per l’uso nella fase di rilevamento ELISA. L’enzima più comune è la perossidasi di rafano (HRP), che può scindere le molecole substrato orto-fenilendiammina dicloridrato (OPD) e tetrametilbenzidina (TMB), tra gli altri. La scissione di entrambi OPD e TMB risulta in un colore giallo e la densità ottica o l’assorbanza della luce di questi substrati viene misurata da un lettore di piastre ELISA. L’assorbimento della luce dell’OPD viene misurato a una lunghezza d’onda di 490 nanometri (nm) mentre il TMB viene misurato a 450 nm.
Un altro enzima comune utilizzato nella fase di rilevamento ELISA è la fosfatasi alcalina. Questo enzima viene utilizzato con il substrato p-nitrofenil fosfato (PNPP) e produce anche una soluzione gialla. PNPP assorbe la luce a una lunghezza d’onda di 405 nm.
La selezione delle combinazioni di substrati enzimatici si basa solitamente su quali anticorpi marcati con enzimi sono disponibili in commercio, nonché su quale attrezzatura verrà utilizzata per misurare l’assorbimento della luce. Le numerose combinazioni disponibili per il rilevamento ELISA rendono il test ELISA altamente versatile. È uno strumento importante nei test sulle malattie e nei laboratori di ricerca.