L’ibridazione fluorescente in situ, nota anche come ibridazione fluorescente in situ, ? pi? comunemente indicata come FISH. ? una tecnica che prevede l’utilizzo di un breve filamento di DNA etichettato con un colorante fluorescente per rilevare anomalie genetiche. FISH consente ai ricercatori di visualizzare cromosomi, parti di cromosomi o geni specifici in modo rapido e accurato. Questo ? spesso usato per determinare la prognosi e il trattamento di alcune malattie, in particolare i tumori.
FISH viene utilizzato per determinare se i cromosomi hanno anomalie. Questo pu? includere delezioni cromosomiche, riarrangiamenti o traslocazioni, in cui due cromosomi hanno scambiato segmenti. FISH consente inoltre ai ricercatori di visualizzare geni specifici. Pu? determinare se un determinato gene ? presente, dove si trova sui cromosomi e se sono presenti pi? copie. Questo ? chiamato mappatura genica.
Il corredo genetico di una persona ? contenuto nel suo DNA, che si trova nei nuclei di tutte le sue cellule. Il DNA ha due filamenti che sono complementari l’uno all’altro. In altre parole, hanno molecole chiamate coppie di basi che corrispondono esattamente tra loro. I geni sono segmenti di DNA che hanno una particolare sequenza di coppie di basi e si trovano su aree specifiche dei cromosomi. I geni vengono ereditati e determinano il funzionamento delle cellule, ma possono anche subire mutazioni se la sequenza delle coppie di basi del DNA cambia.
La tecnica di ibridazione fluorescente in situ sfrutta la natura complementare dei filamenti di DNA. Gli investigatori creano prima una sonda. Questo ? un breve, singolo filamento di DNA che ? complementare alla sequenza genetica che l’investigatore sta cercando. La sonda viene quindi etichettata o fissata a un colorante fluorescente.
Le cellule del tessuto malato, come una biopsia tumorale, di solito costituiscono il campione da esaminare mediante FISH. Il campione viene riscaldato per denaturare il DNA nei nuclei delle cellule. Ci? significa che i doppi filamenti di DNA nelle cellule campione si rompono per formare filamenti singoli. Una sonda FISH specifica viene quindi ibridata con il campione. In altre parole, il singolo filamento della sonda viene introdotto e si fonde con il filamento singolo complementare nelle celle campione denaturate.
Utilizzando uno speciale microscopio a fluorescenza, il ricercatore esamina il campione. Se il gene o il cromosoma specifico ? presente nelle cellule campione, apparir? come una luce fluorescente su uno sfondo pi? scuro. I ricercatori possono facilmente vedere se il gene ? presente o meno e, in caso affermativo, quante copie del gene sono presenti in ciascuna cellula. Se il ricercatore sta cercando la posizione di un gene, pu? vedere dove si trova sul cromosoma. Un normale microscopio ottico non pu? essere utilizzato con FISH, perch? il colorante fluorescente emette un livello di luce molto basso.
L’uso dell’ibridazione del DNA con le sonde ? stato realizzato per la prima volta negli anni ‘1960; tuttavia, le sonde sono state etichettate con sostanze radioattive anzich? fluorescenti. Questo ha avuto diversi problemi. Le sostanze radioattive sono intrinsecamente instabili, pericolose e richiedono protocolli speciali per lo smaltimento. Ci vuole anche molto tempo per misurare il segnale radioattivo emesso dalla sonda ibridata. La tecnica di ibridazione fluorescente in situ supera la maggior parte di questi ostacoli.
Se gli investigatori sanno quale gene stanno cercando, FISH ? veloce e preciso nel trovarlo. La FISH pu? essere eseguita anche se le cellule non si stanno dividendo attivamente e fornisce informazioni pi? specifiche sulle anomalie nei cromosomi. Tecniche pi? convenzionali, come la carotipizzazione, indicano semplicemente agli investigatori il numero e la dimensione dei cromosomi all’interno di una cellula.
L’ibridazione fluorescente in situ presenta degli svantaggi. Poich? la chiave per FISH ? conoscere la sequenza della coppia di basi e/o la posizione di un gene, non pu? essere utilizzato come strumento di screening generale. ? anche pi? costoso di altre tecniche meno specifiche e potrebbe non essere disponibile in tutti i laboratori o ospedali.
I vantaggi e gli svantaggi dell’ibridazione fluorescente in situ sono meglio descritti dall’esempio. Il FISH viene utilizzato di routine nella diagnosi del cancro al seno per determinare se una paziente ha pi? copie di un gene chiamato HER2. Questo di solito indica una forma pi? aggressiva di cancro al seno e che il paziente dovrebbe ricevere determinati farmaci come parte del trattamento. FISH pu? essere utilizzato per questo perch? sono note la sequenza della coppia di basi e la posizione cromosomica del gene HER2. Al contrario, FISH non pu? essere utilizzato per determinare quale gene o geni sconosciuti ha causato il cancro al seno o per lo screening del cancro al seno in generale.