Das Western-Blot-Protokoll ist der genaue Standard, nach dem der Immunoblot-Test durchgeführt wird. Western Blot wird verwendet, um Proteine in einer Gewebeprobe nachzuweisen. Das Verfahren trennt native Proteine, indem die Längen der Polypeptide unter Verwendung einer Gelelektrophorese bestimmt werden. Die Proteine selbst werden dann auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und von Antikörpern sondiert.
Der erste Teil des Western-Blot-Protokolls beginnt mit der Gewebeentnahme. Diese Proben werden entweder aus lebendem Gewebe oder aus einer Zellkultur gewonnen. Das Gewebe wird abgebaut und verschiedene Inhibitoren wie Protease oder Phosphatase werden eingeführt, um die Verdauung von Enzymen zu verhindern. Dieser Teil des Protokolls wird normalerweise bei kalten Temperaturen gehandhabt, um das Gewebe zu schonen.
Das Gelelektrophoreseverfahren ist der nächste Schritt im Western-Blot-Protokoll. In diesem Abschnitt werden die Proteine durch verschiedene Faktoren wie Molekulargewicht oder elektrische Ladung identifiziert. Dieser Prozess wird am häufigsten unter Verwendung von Polyacrylamidgelen mit einem Puffer aus Natriumdodecylsulfat durchgeführt. Grundsätzlich werden die Proteine negativ geladen und bewegen sich innerhalb des Gels zu einer positiv geladenen Elektrode.
Der Transfer der Proteine ist der nächste Teil des gesamten Western-Blot-Prozesses. Auf das Gel wird eine Membran gelegt, gefolgt von Filterpapier. Wenn elektrischer Strom verabreicht wird, werden Proteine in die Membran gezogen. Dies wird als der eigentliche „Blotting“-Teil der Analyse bezeichnet. Die Membranen sind sehr zerbrechlich und leicht anfällig für Beschädigungen.
Der korrekte Ablauf des Western-Blot-Protokolls erfordert den als Bindung bekannten Schritt. Um eine Kontamination der Proteine selbst durch die zuzusetzenden Antikörper zu verhindern, muss eine Art Abschirmung implementiert werden. Die häufigste Art der Blockierung verwendet fettarme Trockenmilch und ein Reinigungsmittel. Dies bindet an die offenen Stellen in der Membran und ermöglicht klarere Ergebnisse bei der Zugabe des Antikörpers.
Die Erkennung ist der nächste Schritt gemäß dem korrekten Protokoll. Die Proteine werden in Antikörper eingebracht, die mit einem bestimmten Enzym verknüpft sind, das den Forschern die gewünschten Informationen liefert. Der Antikörper wird mit der Membran 30 Minuten oder länger inkubiert. Danach wird die Membran gewaschen und ein sekundärer Antikörper eingeführt, der an den ersten bindet. Oft wird ein Lumineszenzmittel verwendet, um Wissenschaftler beim Identifizierungsprozess zu unterstützen.
Das Material wird erneut gewaschen, um ungebundene Gegenstände zu entfernen. Die Analyse der Größe der gefärbten Banden liefert Informationen über die Prominenz und das Ausmaß eines bestimmten Proteins. Dies wird im Allgemeinen einige Male durchgeführt, um eine ordnungsgemäße Analyse zu gewährleisten. Zu den Erkennungsoptionen gehören Röntgenstrahlen, Färbung und Chemikalien.