Un espectrofotómetro es uno de los instrumentos científicos que se encuentran comúnmente en muchos laboratorios de investigación e industriales. Los espectrofotómetros se utilizan para la investigación en laboratorios de física, biología molecular, química y bioquímica. Normalmente, el nombre se refiere a espectroscopía ultravioleta-visible (UV-Vis).
La energía de la luz depende de su longitud de onda, generalmente designada como lambda. Aunque el espectro electromagnético se extiende sobre una enorme gama de longitudes de onda, la mayoría de los laboratorios solo pueden medir una pequeña fracción de ellas. La espectroscopia UV-Vis mide entre 200 y 400 nanómetros (nm) para las mediciones de luz ultravioleta, y hasta aproximadamente 750 nm en el espectro visible.
Para la espectroscopía UV-Vis, las muestras generalmente se contienen y se miden en pequeños recipientes llamados cubetas. Estos pueden ser de plástico si se usan en el espectro visible, pero deben ser de cuarzo o sílice fundida si se usan para mediciones UV. Hay algunas máquinas que pueden utilizar tubos de ensayo de vidrio.
La espectroscopia visible se utiliza a menudo industrialmente para colorimetría. Con este método, las muestras se miden en múltiples longitudes de onda de 400 a 700 nm y sus perfiles de absorbancia se comparan con un estándar. Esta técnica es utilizada con frecuencia por los fabricantes de textiles y tintas. Otros usuarios comerciales de espectroscopia UV-Vis incluyen laboratorios e impresoras forenses.
En la investigación biológica y química, las soluciones a menudo se cuantifican midiendo su grado de absorción de luz a una longitud de onda particular. Se usa un valor llamado coeficiente de extinción para calcular la concentración del compuesto. Por ejemplo, los laboratorios de biología molecular utilizan espectrofotómetros para medir las concentraciones de muestras de ADN o ARN. A veces tienen una máquina avanzada llamada espectrofotómetro NanoDrop ™ que usa una fracción de la cantidad de muestra en comparación con la que usan los espectrofotómetros tradicionales.
Para que la cuantificación sea válida, la muestra debe obedecer la Ley de Beer-Lambert. Esto requiere que la absorbancia sea directamente proporcional a la longitud de la trayectoria de la cubeta y la absorción del compuesto. Hay tablas de coeficientes de extinción disponibles para muchos compuestos, pero no para todos.
Muchas reacciones químicas y enzimáticas cambian de color con el tiempo y los espectrofotómetros son muy útiles para medir estos cambios. Por ejemplo, las enzimas polifenol oxidasa que hacen que la fruta se ponga marrón oxidan las soluciones de compuestos fenólicos, cambiando las soluciones transparentes a otras que tienen un color visible. Estas reacciones pueden ensayarse midiendo el aumento de absorbancia a medida que cambia el color. Idealmente, la tasa de cambio será lineal y se pueden calcular tasas a partir de estos datos. Un espectrofotómetro más avanzado tendrá un portacubetas de temperatura controlada para llevar a cabo las reacciones a una temperatura precisa ideal para la enzima.
Los laboratorios de biología microbiológica y molecular utilizan con frecuencia un espectrofotómetro para medir el crecimiento de cultivos de bacterias. Los experimentos de clonación de ADN a menudo se realizan en bacterias y los investigadores deben medir la etapa de crecimiento del cultivo para saber cuándo llevar a cabo ciertos procedimientos. Miden la absorbancia, que se conoce como densidad óptica (DO), en un espectrofotómetro. A partir de la DO, se puede saber si las bacterias se están dividiendo activamente o si están empezando a morir.
Los espectrofotómetros usan una fuente de luz para hacer brillar una variedad de longitudes de onda a través de un monocromador. Este dispositivo luego transmite una banda estrecha de luz y el espectrofotómetro compara la intensidad de la luz que pasa a través de la muestra con la que pasa a través de un compuesto de referencia. Por ejemplo, si un compuesto se disuelve en etanol, la referencia sería etanol. El resultado se muestra como el grado de absorbancia de la diferencia entre ellos. Esto indica la absorbancia del compuesto de muestra.
La razón de esta absorbancia es que tanto la luz ultravioleta como la visible tienen suficiente energía para excitar las sustancias químicas a niveles más altos de energía. Esta excitación da como resultado una longitud de onda más alta, que es visible cuando la absorbancia se representa frente a la longitud de onda. Diferentes moléculas o compuestos inorgánicos absorben energía en diferentes longitudes de onda. Aquellos con máxima absorción en el rango visible son vistos como coloreados por el ojo humano.
Las soluciones de compuestos pueden ser transparentes, pero se absorben en el rango de los rayos ultravioleta. Estos compuestos suelen tener dobles enlaces o anillos aromáticos. A veces hay uno o más picos detectables cuando el grado de absorción se representa frente a la longitud de onda. Si es así, esto puede ayudar en la identificación de algunos compuestos comparando la forma del gráfico con la de los gráficos de referencia conocidos.
Hay dos tipos de espectrofotómetros UV-Vis, de haz simple y de haz doble. Estos difieren en cómo miden la intensidad de la luz entre la referencia y la muestra de prueba. Las máquinas de doble haz miden el compuesto de prueba y de referencia simultáneamente, mientras que las máquinas de haz simple miden antes y después de agregar el compuesto de prueba.