Ubiquitinação se refere à ligação da proteína ubiquitina a outras proteínas por três enzimas diferentes. Um ensaio de ubiquitinação é um teste que determina quanto desse processo ocorre dentro da célula. Os testes podem ser usados para determinar como diferentes condições afetam a ligação de proteínas, etapas e estruturas que são importantes na via de ubiquitinação e a quantidade de proteína na célula. Quantidades inadequadas ou superabundantes têm sido associadas ao desenvolvimento de muitas doenças diferentes.
Uma proteína encontrada nas células, a função da ubiquitina é se ligar a proteínas enquanto funciona como uma etiqueta ou sinal para outras estruturas. Essa etiqueta então sinaliza às enzimas que sabem que a proteína pode ser destruída, reciclada ou movida. O resultado é a destruição ou transporte de proteínas.
Essas proteínas marcadoras são importantes para o reparo do DNA, infecções virais e resposta imune. Outras funções importantes incluem papéis na morte celular, divisão celular e desenvolvimento de células. O excesso de ubiquitina, ou a falta dela, pode desempenhar um papel na formação de muitas doenças, como câncer, distúrbios genéticos e doenças do sistema imunológico.
Os pesquisadores usarão um ensaio de ubiquitinação para tentar determinar quais condições alteram a concentração da proteína na célula e comparando células doentes com células saudáveis. Os cientistas também o usam para investigar quais condições causarão mudanças na ligação. Além disso, eles podem tentar vincular o código de DNA específico com a quantidade de enzimas na célula.
Existe mais de um tipo de ensaio de ubiquitinação que os cientistas usam especificamente. Um determinará a porcentagem de proteínas que estão ligadas à ubiquintina. Outro examina a atividade de enzimas ou a presença de quaisquer outros intermediários encontrados na via de ubiquinação. Diferentes ensaios são desenvolvidos com base na proteína-alvo à qual a ubiquitina se liga.
A base de um ensaio de ubiquitinação é incorporar um composto que é rotulado com outro produto químico facilmente mensurável. Em ensaios oncológicos, a ubiquitina pode ser marcada com criptato, um composto que contém dois átomos de nitrogênio. Isso pode ser usado para determinar qual enzima é mais ativa na célula.
Um ensaio de ubiquitinação terá duas etapas. A primeira é uma etapa enzimática em que as enzimas ligam a ubiquitina marcada à proteína alvo. A segunda é uma etapa de detecção em que a ligação da proteína alvo é examinada usando um conjugado, como um anticorpo. O anticorpo ficará fluorescente ou mudará de cor, o que permitirá ao pesquisador determinar a atividade das enzimas.