Ubiquitinierung bezeichnet die Bindung des Proteins Ubiquitin an andere Proteine durch drei verschiedene Enzyme. Ein Ubiquitinierungsassay ist ein Test, der bestimmt, wie viel von diesem Prozess innerhalb der Zelle abläuft. Tests können verwendet werden, um zu bestimmen, wie unterschiedliche Bedingungen die Proteinbindung, Schritte und Strukturen, die für den Ubiquitinnierungsweg wichtig sind, und die Proteinmenge in der Zelle beeinflussen. Unzureichende oder übermäßige Mengen wurden mit der Entwicklung vieler verschiedener Krankheiten in Verbindung gebracht.
Ubiquitin ist ein Protein, das in Zellen vorkommt. Die Funktion von Ubiquitin besteht darin, an Proteine zu binden, während es als „Tag“ oder Signal für andere Strukturen fungiert. Dieses „Tag“ signalisiert dann Enzymen, dass das Protein zerstört, recycelt oder bewegt werden kann. Das Ergebnis ist die Zerstörung oder der Transport von Proteinen.
Diese Markierungsproteine sind wichtig für die DNA-Reparatur, virale Infektionen und die Immunantwort. Andere wichtige Funktionen umfassen Rollen beim Zelltod, der Zellteilung und der Entwicklung von Zellen. Zu viel oder ein Mangel an Ubiquitin kann bei der Entstehung vieler Krankheiten wie Krebs, genetischen Störungen und Erkrankungen des Immunsystems eine Rolle spielen.
Mit einem Ubiquitinierungsassay wollen die Forscher herausfinden, unter welchen Bedingungen die Konzentration des Proteins in der Zelle verändert wird, und erkrankte Zellen mit gesunden Zellen vergleichen. Wissenschaftler verwenden es auch, um zu untersuchen, welche Bedingungen eine Änderung der Bindung verursachen. Darüber hinaus können sie versuchen, einen spezifischen DNA-Code mit der Menge an Enzymen in der Zelle zu verknüpfen.
Es gibt mehr als eine Art von Ubiquitinierungsassay, die Wissenschaftler speziell verwenden. Man wird den Prozentsatz der Proteine bestimmen, die mit Ubiquintin gebunden sind. Ein anderer untersucht die Aktivität von Enzymen oder das Vorhandensein anderer Zwischenprodukte, die im Ubiquinierungsweg gefunden werden. Basierend auf dem Zielprotein, an das Ubiquitin bindet, werden verschiedene Assays entwickelt.
Die Grundlage eines Ubiquitinierungsassays besteht darin, eine Verbindung einzubauen, die unter Verwendung einer anderen leicht zu messenden Chemikalie markiert wird. In onkologischen Assays kann Ubiquitin mit Kryptat markiert werden, einer Verbindung, die zwei Stickstoffatome enthält. Dies kann verwendet werden, um zu bestimmen, welches Enzym in der Zelle am aktivsten ist.
Ein Ubiquitinierungsassay besteht aus zwei Schritten. Der erste ist ein enzymatischer Schritt, bei dem Enzyme das markierte Ubiquitin an das Zielprotein binden. Der zweite ist ein Nachweisschritt, bei dem die Bindung des Zielproteins unter Verwendung eines Konjugats wie eines Antikörpers untersucht wird. Der Antikörper wird fluoreszieren oder seine Farbe ändern, wodurch der Forscher die Aktivität der Enzyme bestimmen kann.