Un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) es una prueba que se realiza en un laboratorio de inmunología para determinar los niveles de proteína en una muestra biológica. La detección de ELISA se refiere al paso final de la prueba en el que se agrega una solución transparente, o sustrato, a una placa de plástico que contiene un anticuerpo marcado con enzima unido. La enzima escinde el sustrato y se produce un cambio de color. A continuación, se mide la absorbancia de la luz de la solución coloreada final en un lector de placas ELISA o en un espectrofotómetro.
Existen varios tipos de pruebas ELISA, siendo las dos más comunes la ELISA indirecta y la ELISA de captura o sándwich. El ELISA indirecto se utiliza para detectar una proteína, conocida como anticuerpo, en el suero de un paciente. Un ejemplo de prueba ELISA indirecta es la prueba del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) que se utiliza para detectar anticuerpos contra el VIH. La prueba ELISA sándwich detecta una proteína o antígeno al capturarlo entre dos anticuerpos. La detección de la hormona gonadotropina coriónica humana (hCG), que se encuentra elevada durante el embarazo, se realiza con una prueba ELISA tipo sándwich.
Ambas pruebas tienen un paso de detección ELISA al final del ensayo. Este paso implica la adición de un anticuerpo al que se le ha unido una molécula de enzima. Después de la adición del anticuerpo marcado con enzima, se agrega una solución incolora que contiene la molécula de sustrato específica para esa enzima. La enzima escinde la molécula de sustrato y la solución cambia de color según la combinación utilizada. La determinación de la cantidad de anticuerpo o antígeno en la muestra del paciente se realiza midiendo la intensidad del cambio de color.
Hay varias combinaciones de sustrato enzimático disponibles para su uso en el paso de detección de ELISA. La enzima más común es la peroxidasa de rábano picante (HRP), que puede escindir las moléculas de sustrato orto-fenilendiamina diclorhidrato (OPD) y tetrametilbencidina (TMB), entre otras. La escisión de OPD y TMB da como resultado un color amarillo, y la densidad óptica o absorbancia de la luz de estos sustratos se mide mediante un lector de placas ELISA. La absorbancia de luz de OPD se mide a una longitud de onda de 490 nanómetros (nm) mientras que la TMB se mide a 450 nm.
Otra enzima común utilizada en el paso de detección de ELISA es la fosfatasa alcalina. Esta enzima se usa con el sustrato p-nitrofenil fosfato (PNPP) y también produce una solución amarilla. PNPP absorbe luz a una longitud de onda de 405 nm.
La selección de las combinaciones de sustrato enzimático generalmente se basa en qué anticuerpos marcados con enzima están disponibles comercialmente, así como en qué equipo se utilizará para medir la absorbancia de luz. Las numerosas combinaciones disponibles para la detección ELISA hacen que la prueba ELISA sea muy versátil. Es una herramienta importante en los laboratorios de investigación y pruebas de enfermedades.