Un microscope confocal est un type particulier de microscope à fluorescence utilisé pour obtenir des images 2D et 3D de haute qualité. Avec un microscope à fluorescence de base (grand champ), une lumière d’une longueur d’onde particulière est projetée sur un échantillon, et l’échantillon absorbe une partie de cette lumière et réfléchit le reste à une longueur d’onde plus longue. La lumière de longueur d’onde plus longue passe à travers un miroir dichroïque, ce qui permet à la lumière de longueur d’onde plus longue, mais pas à la lumière de longueur d’onde d’origine (plus courte) de passer. La personne qui regarde l’échantillon ne voit que la lumière qui a traversé le miroir dichroïque. Les microscopes à fluorescence de base capturent à la fois la lumière focalisée et la lumière floue, ce qui fonctionne bien pour les grands spécimens où une très haute résolution n’est pas requise. Cela ne fonctionne pas si bien pour visualiser les détails fins. Un microscope confocal est nécessaire pour capturer des images fluorescentes à haute résolution.
Le microscope confocal utilise un trou d’épingle pour rejeter la lumière floue. Au lieu de la lumière passant uniquement à travers un miroir dichroïque, la lumière traverse à la fois un miroir dichroïque et un trou d’épingle, ce qui signifie que la personne qui regarde l’échantillon ne voit qu’un seul point de l’échantillon. Afin de visualiser un échantillon entier, des miroirs mobiles balayent la lumière sur un plan rectangulaire de l’échantillon, et un ordinateur collecte la lumière émise au fur et à mesure que l’échantillon est numérisé. Un balayage complet donnera une coupe optique, ou coupe transversale, de l’échantillon. Ce type de microscopie est appelé microscopie confocale à balayage laser, en partie parce qu’un laser est utilisé comme source lumineuse.
Pour créer une image 3D, plusieurs scans sont effectués, créant plusieurs tranches de l’échantillon, et un ordinateur combine chaque tranche pour créer une image en trois dimensions. Le microscope peut être programmé pour faire varier l’espace entre les tranches, en fonction de la netteté d’une image 3D que l’utilisateur souhaite obtenir. Le microscope peut également faire varier la vitesse à laquelle il numérise une image, un balayage lent donnant une résolution plus élevée qu’un balayage rapide.
Le microscope confocal est devenu un équipement très couramment utilisé dans de nombreux laboratoires de sciences de la vie. Ils sont chers, un peu grands, et ont souvent des pièces dédiées à leur usage, car la pièce doit être sombre pour obtenir une bonne image fluorescente. Bien que les microscopes confocaux soient le plus souvent utilisés pour visualiser les cellules et les structures à l’intérieur des cellules, ils peuvent être utilisés pour obtenir une image de tout spécimen fluorescent tridimensionnel et sont parfois utilisés pour visualiser des matériaux semi-conducteurs.