Il sequenziamento del bisolfito è un metodo in cui vengono analizzate diverse regioni del DNA utilizzando la metilazione. La metilazione è il processo di aggiunta di una molecola specifica, chiamata gruppo metilico, a un nucleotide, in questo caso solitamente una citosina. I nucleotidi inattivi sono spesso metilati, quindi questo metodo può essere utilizzato per una varietà di scopi, dalla determinazione delle regioni attive di un genoma all’identificazione delle regioni ricche di geni. Nel sequenziamento del bisolfito, le citosine metilate non sono influenzate dal processo di sequenziamento, mentre le citosine non metilate vengono convertite in uracile, un nucleotide che di solito non si trova nel materiale genetico, l’acido desossiribonucleico (DNA).
Questo metodo è molto sensibile ai cambiamenti nella metilazione, quindi piccoli cambiamenti nel legame possono fornire ai ricercatori informazioni specifiche su particolari nucleotidi. Il bisolfito di sodio converte la citosina in uracile, ma la conversione avviene in un ambiente in cui la citosina metilata non subirà questo cambiamento. Quando il sequenziamento del bisolfito è completo, il DNA originale è stato convertito in una molecola significativamente diversa. Le citosine saranno notevolmente ridotte o potenzialmente assenti. Se una citosina si trova ancora in questa molecola convertita, rappresenta una citosina naturalmente metilata nel genoma in esame.
Come tutti i protocolli sperimentali, il sequenziamento con bisolfito presenta degli svantaggi. Il suo svantaggio più significativo è che richiede una concentrazione di sale molto elevata per funzionare correttamente. Il sale incoraggia la ricottura del DNA a singolo filamento nella sua doppia elica più naturale e il bisolfito di sodio non può sempre raggiungere le citosine quando fanno parte del DNA a doppio filamento. Se la concentrazione di sale è troppo alta, un certo numero di citosine potrebbe non essere convertito in uracile, con conseguente falsa identificazione delle citosine metilate all’interno di un genoma. Possono essere necessari agenti denaturanti per ridurre al minimo il numero di identificazioni false positive.
Non sono necessarie grandi quantità di dati genomici per il sequenziamento con bisolfito, quindi il metodo ha un’utile applicazione nell’analisi di campioni clinici. La fonte originale dell’acido nucleico non ha importanza, ma la fonte deve essere il DNA. In teoria, l’acido ribonucleico (RNA) potrebbe essere sequenziato utilizzando questo metodo, poiché la maggior parte dell’RNA è a singolo filamento e non sarebbe così suscettibile ai falsi positivi a causa dei nucleotidi bloccati. Quando viene messo in pratica, tuttavia, il sequenziamento con bisolfito non è utile per l’RNA, perché l’RNA contiene naturalmente uracile. Senza una sorta di marcatura esterna o aggiunta al protocollo, le citosine convertite sarebbero indistinguibili dall’uracile naturale.
Quando si intraprende qualsiasi tipo di metodologia di sequenziamento, accuratezza e precisione sono essenziali. Metodi sensibili come il sequenziamento con bisolfito offrono un mezzo affidabile di analisi della sequenza, che a sua volta consente l’analisi genica e l’identificazione di bersagli per farmaci e terapie. Sebbene questo metodo non possa essere utilizzato su persone viventi, può comunque essere di grande aiuto con solo il più piccolo dei campioni di tessuto con cui lavorare.