Los búhos juegan un papel importante en la mitología de muchas culturas alrededor del mundo. En la mitología, pueden ser compañeros de dioses, espíritus malignos, observadores sabios o la encarnación de las fuerzas naturales. En muchas culturas, los búhos son mensajeros de la muerte o están asociados con los poderes del inframundo. Esta connotación negativa puede surgir del hecho de que los búhos son nocturnos; los animales que están activos durante la noche a menudo tienen papeles negativos en el mito y el folclore.
Los búhos más famosos de la mitología son probablemente los asociados con Atenea, la diosa griega de la sabiduría y la guerra, deidad patrona de la ciudad de Atenas. Los artistas representaron a Atenea con un búho en un hombro. Los búhos pueden haber estado conectados con la diosa debido a su capacidad para ver bien de noche y sus grandes ojos, que evocaban su epíteto, «Atenea de ojos brillantes». Como resultado de esta asociación, los búhos continúan siendo símbolos de sabiduría en el mundo occidental. Un género de búhos conserva el nombre de «Atenea».
La mitología de otras partes del mundo a menudo le da a los búhos un papel más siniestro. Aunque los romanos adoptaron muchos elementos de la religión griega, el folclore romano también presentaba peligrosas criaturas parecidas a búhos que podían succionar la fuerza vital de un bebé. Del mismo modo, en la mitología árabe, los búhos eran pájaros de mal agüero. La leyenda decía que los búhos ululaban sobre las tumbas de los hombres asesinados y se pensaba que sus huevos tenían propiedades sobrenaturales. Se sabe que existen o han existido creencias similares en el África subsahariana, donde los búhos desempeñan el papel de precursores de la muerte o portadores de mala suerte.
En América del Sur y Central, los búhos están nuevamente conectados con la muerte y el inframundo. En la mitología maya, Xibalba, «el lugar del miedo», está gobernado por dos dioses de la muerte, Hun-Came («Una muerte») y Vucub-Came («Siete muertes»). Sus mensajeros son cuatro espíritus que toman la forma de búhos. Del mismo modo, el dios azteca Mictlantecuhtli, dios de los muertos, aparece como un esqueleto con un tocado de plumas de búho.
Las naciones nativas americanas de América del Norte tenían una amplia variedad de roles diferentes para los búhos en su mitología. En algunas culturas, el búho desempeñaba el papel de mensajero del inframundo, mientras que en otras, como los sioux, era un guardián que protegía la entrada al más allá. La nación Passamaquoddy contó una historia en la que el pájaro era un espíritu servicial que proporcionaba a los humanos dones mágicos.