La citometría de flujo es el estudio de células individuales a medida que pasan a través de una corriente líquida. Los componentes de la célula, ya sea internamente o en la superficie, primero deben etiquetarse con uno o más tintes fluorescentes. Un láser dentro de un instrumento llamado citómetro de flujo excita estas moléculas fluorescentes para que emitan luz en varias longitudes de onda. La cantidad de fluorescencia puede dar una indicación de qué porcentaje de varios tipos de células están presentes en la muestra. La citometría de flujo se utiliza en laboratorios para una variedad de aplicaciones, incluida la investigación del cáncer, la inmunología y el análisis del ciclo celular.
Para realizar el análisis de citometría de flujo, se debe teñir una suspensión de células individuales con tintes fluorescentes, lo que se puede realizar en un proceso de uno o dos pasos. Las proteínas celulares a menudo se tiñen con anticuerpos dirigidos contra la proteína de interés. Un proceso de un solo paso implica teñir células con anticuerpos que ya están marcados con tinte fluorescente. Si los anticuerpos marcados no están disponibles, las células se pueden teñir primero con un anticuerpo primario sin marcar y luego con un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia.
Una vez que las células están etiquetadas, están listas para el análisis de citometría de flujo. Se carga un tubo que contiene la suspensión de células en el citómetro de flujo. Las células fluyen a través del instrumento y pasan frente a un láser en una sola fila. A medida que el láser golpea cada celda, la luz se dispersa hacia adelante o hacia los lados. Las medidas de dispersión hacia adelante dan una indicación del tamaño de la celda, mientras que la dispersión lateral es una medida de la granularidad de las celdas.
La energía del láser también excita las moléculas de fluorocromo, el tinte fluorescente que se usa para teñir las células. Un láser común utilizado para la citometría de flujo es el láser de iones de argón que emite luz a una longitud de onda de 488 nanómetros (nm). Esta luz excita las moléculas del tinte verde fluoresceína, que luego emite luz a una longitud de onda de 525 nm. Los tubos fotomultiplicadores (PMT) del citómetro de flujo tienen filtros de luz que detectan la luz emitida por los distintos fluorocromos. El instrumento puede tener varios PMT que detectan luz en diferentes longitudes de onda.
El diodo rojo, el diodo violeta o He-Ne (helio-neón) son otros láseres que pueden usarse en un citómetro de flujo. Otros fluorocromos utilizados en el análisis de citometría de flujo incluyen ficoeritrina, rojo Texas o aloficocianina. Las diferentes combinaciones de láseres y fluorocromos permiten al investigador recopilar información sobre muchos marcadores celulares diferentes en el mismo experimento.
El software diseñado para su uso con el citómetro de flujo ayuda al investigador a visualizar los datos. Las poblaciones de células se analizan utilizando gráficos de puntos, gráficos de densidad o histogramas. Se pueden dibujar regiones alrededor de las células de interés y la intensidad de la fluorescencia puede dar una indicación de los porcentajes de varias células en la muestra.