Il sequenziamento shotgun è un metodo di sequenziamento del DNA in base al quale un lungo tratto di DNA viene rotto fisicamente in piccoli frammenti (circa 2,000 coppie di basi) che vengono clonati, sequenziati e assemblati utilizzando l’analisi del computer. È stato sviluppato e reso famoso da Craig Venter di Celera Corporation. Venter ha sviluppato la tecnica nel 1996 mentre lavorava presso l’Istituto per la ricerca sul genoma.
Venter ha fondato Celera nel 1998 con la missione di sequenziare il genoma umano entro tre anni. Questo obiettivo era in diretta concorrenza con il già operativo Human Genome Project, un consorzio di università che lavorano insieme per sequenziare il genoma umano utilizzando una vecchia strategia chiamata sequenziamento basato su mappe o BAC-to-BAC. Questo metodo prevedeva prima la rottura del genoma in 150,000 pezzi di coppie di basi chiamati BAC, l’assemblaggio dei BAC in ordine e quindi il sequenziamento dettagliato di ciascun BAC.
Il sequenziamento dell’intero genoma bypassa la creazione e la mappatura dei BAC e inizia proprio con il sequenziamento del DNA. Il processo inizia con l’acquisizione di un campione di DNA ad alto peso molecolare dall’organismo di interesse e la sua rottura fisica in piccoli pezzi facendolo passare attraverso una siringa a scartamento ridotto o sonicandolo, un modo per rompere il campione utilizzando onde sonore. Il taglio è un processo casuale, quindi le sequenze dei frammenti avranno una certa sovrapposizione tra loro. Il taglio non crea specificamente i 2,000 frammenti di coppie di basi necessari per il sequenziamento, ma i frammenti della dimensione desiderata devono essere purificati dalla miscela.
Il prossimo passo è unire i frammenti di DNA con il DNA vettore chiamato vettore. Questo processo è noto come clonazione e crea una libreria di sequenziamento da cui verrà creata la sequenza di un intero genoma. Viene determinata la sequenza di ciascun clone nella libreria e viene utilizzata l’analisi computerizzata per trovare sequenze sovrapposte o continue in ciascun frammento. L’assemblaggio delle sovrapposizioni crea un “contig”, che è un lungo tratto continuo di sequenza di DNA.
La clonazione del fucile a pompa di solito si tradurrà in alcuni spazi tra i contig perché alcune sequenze mancano per caso dalla libreria. Le lacune possono essere colmate creando una nuova libreria o utilizzando sequenze note per estendersi verso l’esterno dal contig. Poiché il sequenziamento del fucile sequenziale frammenti di DNA in modo casuale, molti frammenti vengono sequenziati più di una volta, creando una maggiore certezza che la sequenza sia corretta rispetto a se ogni frammento fosse stato sequenziato solo una o due volte.
Il genoma umano è stato sequenziato sia dallo Human Genome Project utilizzando il sequenziamento basato su mappe sia da Celera utilizzando il sequenziamento shotgun. Il sequenziamento shotgun è ora il metodo preferito per altri tipi di sequenziamento del genoma. I genomi completi di molti organismi, come la pianta Arabidopsis thaliana, il riso, la mucca, il cane, il pollo, lo scimpanzé, il ratto, il topo, il pesce palla e molti microrganismi sono stati sequenziati in questo modo.