Es gibt Hunderte von verschiedenen Methoden zur Bestimmung der Proteinkonzentration. Die unglaubliche Vielfalt der Arten von Proteinlösungen, die Biochemiker analysieren, ist der Grund, warum es keine einzige universelle Methode gibt, die für jede Art von Proteinlösung funktioniert. Die gebräuchlichsten Proteinassays sind der Bradford-Assay, der Lowry-Assay und der Bicinchoninsäure-Assay. Nichtsdestotrotz wurden nach Bedarf unzählige Variationen entwickelt, um mögliche chemische Inkompatibilitäten zwischen der Proteinlösung und den Reagenzien, die in dem Assay verwendet werden, zu umgehen.
Im Allgemeinen gibt es zwei Hauptkategorien von Assays zur Bestimmung der Proteinkonzentration. Bei der ersten Methodengruppe wird einer Proteinlösung ein bunter oder fluoreszierender Farbstoff zugesetzt, der spezifisch an Protein bindet. Der gebundene Farbstoff hat eine einzigartige Absorptionswellenlänge, die proportional zur Proteinmenge ist. Durch die Verwendung eines Spektrometers wird es möglich, die Proteinkonzentration abzuschätzen.
Die zweite Gruppe von Assays beinhaltet die Zugabe von Kupfer(II)-Ionen zu einer Proteinlösung, wobei diese Ionen zu Kupfer(I)-Ionen reduziert werden. Diese reduzierten Ionen können dann durch Bindung an Proteine bunte Komplexe bilden. Durch Messung der Extinktionen bei ihren einzigartigen Wellenlängen können ebenfalls die Proteinkonzentrationen abgeleitet werden.
Eine der beliebtesten Methoden zur Bestimmung der Proteinkonzentration ist der Bradford-Assay. Bei diesem Assay wird einer Proteinlösung unter sauren Bedingungen ein roter Farbstoff namens Coomassie Brilliant Blue zugesetzt. Da dieser Farbstoff an Protein bindet, bildet er einen permanenten blauen Komplex mit einer charakteristischen Absorption bei 595 Nanometern.
Trotz der allgemeinen Vielseitigkeit des Bradford-Assays ist er mit einigen Proteinlösungen nicht kompatibel. Insbesondere wird der Bradford-Assay durch die Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat (SDS) gestört, einem Detergens, das üblicherweise verwendet wird, um Proteine zu reinigen und Zellen durch Lyse abzubauen. Dieses Detergens stört die Bindung des Farbstoffs an Proteine, was zu einer unzuverlässigen und ungenauen Absorptionsmessung führt. Andere Arten von Methoden müssen dann verwendet werden, wenn SDS vorhanden ist.
Es wurde eine weitere Reihe von Proteinassays entwickelt, die alle eine Variation des Biuret-Tests beinhalten. Bei dieser Reaktion wird ein Protein mit einer wässrigen Base und Kupfer(II)-Ionen kombiniert. Diese Ionen werden reduziert und dann von Proteinen chelatisiert, um bunte Komplexe zu bilden. Zwei Tests, die diesen Test verwenden, sind der Lowry-Test und der Bicinchoninsäure-Test.
Beim Lowry-Test wird dem Biuret-Test ein Folin-Ciocalteu-Reagenz zugesetzt. Das Folin-Ciocalteu-Reagenz oxidiert aromatische Reste, insbesondere Tryptophan, und hilft dem Komplex, bei 750 Nanometern stark zu absorbieren. Der Bicinchoninsäure-Assay beinhaltet andererseits die Zugabe von Bicinchoninsäure zum Biuret-Test. Nach einer kurzen Inkubation bei etwa 104° Fahrenheit (40° Celsius) chelieren zwei Äquivalente Säure und die Peptidbindungen des Proteins ein einzelnes Kupfer(I)-Ion. Das Ergebnis ist ein Komplex, der bei 562 Nanometern stark absorbiert.
Bei der Auswahl einer Methode zur Bestimmung der Proteinkonzentration ist es wichtig, die verschiedenen in der Lösung vorhandenen chemischen funktionellen Gruppen zu berücksichtigen. Das Vorhandensein bestimmter Aminosäureseitenketten, Disulfidbindungen und Cofaktoren kann die Bestimmung der Proteinkonzentration sehr ungenau machen. Es ist oft notwendig, nicht nur die Proteine, sondern auch andere Reagenzien und Puffer, wie Reduktionsmittel und Detergenzien, zu berücksichtigen. Die ideale Methode ist chemisch kompatibel sowie zuverlässig, kostengünstig und einfach einzurichten.