El pan de masa fermentada es único porque no requiere ninguna levadura comprada en la tienda, al igual que otros panes en crecimiento. Presenta un cultivo simbiótico de levadura y bacterias que surge naturalmente de los microorganismos presentes en la harina. Se puede agregar un cultivo iniciador, especialmente para producir un sabor específico, como el asociado con la levadura Candida milleri y la bacteria Lactobacillus sanfranciscensis del pan de masa fermentada de San Francisco, pero no es necesario. Todo lo que se necesita para hacer un cultivo de masa madre es harina y agua.
La bacteria en un cultivo de pan de masa fermentada es Lactobacillus, o bacteria del ácido láctico, que también se usa en alimentos como chucrut, kimchi, encurtidos, queso y yogur. Es esta bacteria la que le da a este pan su sabor ácido característico, mientras que la levadura permite que el pan se levante. La levadura y las bacterias presentes de forma natural en la harina se activan al mezclarla en agua y dejarla en un ambiente cálido. Los diferentes tipos de harina son más o menos ricos en microorganismos, y a veces se agregan uvas orgánicas sin lavar a la mezcla para aumentar la levadura natural y ayudar al desarrollo de la cultura. La malta diastásica también se puede agregar a un cultivo joven para proporcionar azúcares adicionales para que la levadura se alimente.
Un cultivo de masa fermentada, también conocido como iniciador o esponja, debe ser «alimentado» diariamente cuando es joven con harina fresca y agua. A medida que el cultivo madura, puede refrigerarse y alimentarse con menos frecuencia. Una parte de la cultura se utiliza para cada nueva barra de pan de masa fermentada. Un cultivo de masa madre bien mantenido puede servir a un panadero durante muchos años.
La masa madre es uno de los tipos de pan más antiguos. El pan de centeno 100% común en el norte de Europa es un ejemplo de pan de masa fermentada, y las baguettes y otros panes del sur de Europa se elaboraron tradicionalmente con masa madre antes del advenimiento de los cultivos de levadura de crecimiento más rápido. En los Estados Unidos, el pan de masa fermentada de San Francisco es particularmente famoso. Algunos cultivos de masa madre de San Francisco han estado en uso durante 150 años. El dulce Pan de la Amish Amish, tradicionalmente transmitido a los amigos, es otro ejemplo de pan de masa madre estadounidense.