Le pain au levain est unique car il ne nécessite aucune levure du commerce, comme les autres pains levants. Il présente une culture symbiotique de levures et de bactéries qui découlent naturellement des micro-organismes présents dans la farine. Un levain peut être ajouté, notamment pour produire un arôme spécifique, comme celui associé à la levure Candida milleri et à la bactérie Lactobacillus sanfranciscensis du pain au levain de San Francisco, mais ce n’est pas nécessaire. Tout ce dont on a besoin pour faire une culture de levain, c’est de la farine et de l’eau.
Les bactéries présentes dans une culture de pain au levain sont des lactobacilles, ou bactéries lactiques, qui sont également utilisées dans des aliments tels que la choucroute, le kimchi, les cornichons, le fromage et le yaourt. C’est cette bactérie qui donne à ce pain sa saveur acidulée caractéristique, tandis que la levure permet au pain de lever. La levure et les bactéries naturellement présentes dans la farine sont activées en la mélangeant à de l’eau et en la laissant dans un environnement chaud. Différents types de farines sont plus ou moins riches en micro-organismes, et parfois des raisins biologiques non lavés sont ajoutés au mélange pour augmenter la levure naturelle et aider la culture à se développer. Du malt diastatique peut également être ajouté à une jeune culture pour fournir des sucres supplémentaires dont la levure pourra se nourrir.
Une culture de levain, également appelée entrée ou éponge, doit être nourrie quotidiennement lorsqu’elle est jeune avec de la farine fraîche et de l’eau. Au fur et à mesure que la culture mûrit, elle peut être réfrigérée et nourrie moins souvent. Une partie de la culture est utilisée pour chaque nouvelle miche de pain au levain. Une culture de levain bien entretenue peut servir un boulanger pendant de nombreuses années.
Le levain est l’un des plus anciens types de pain. Le pain de seigle 100 % commun en Europe du Nord est un exemple de pain au levain, et les baguettes et autres pains d’Europe du Sud étaient traditionnellement fabriqués avec du levain avant l’avènement des cultures de levure à croissance plus rapide. Aux États-Unis, le pain au levain de San Francisco est particulièrement réputé. Certaines cultures de levain de San Francisco sont utilisées depuis 150 ans. Le pain sucré Amish Friendship Bread traditionnellement transmis à des amis est un autre exemple de pain au levain américain.